血耳多糖对小鼠Raw264.7 巨噬细胞的免疫调节作用研究

牛 越，王新茹，姚秀君，王君楚，包鸿慧

（1. 湖北文理学院 食品科学技术学院，湖北 襄阳 441000；2. 湖北保侬康血耳科技开发有限公司，湖北 襄阳 441600）

0 引言

免疫是人体重要的防御屏障，无论是对癌症的预防，还是对新冠肺炎病毒的对抗，增强机体免疫力尤为关键[1]。血耳又名血银耳，是一种传统名贵药食兼用珍稀食用菌，具有益气活血，平肝阳、去热毒的功效，常用于妇科疾病、痢疾和急性肝炎等的治疗[2-3]。多糖是食用菌中的主要活性成分，目前对血耳多糖的研究报道不多[4]，而对血耳免疫活性未见报道。采用热水浸提法从血耳子实体中提取血耳多糖，研究其对小鼠巨噬细胞的免疫活性，为血耳资源的研究与开发提供试验科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

血耳，湖北保侬康血耳科技开发有限公司提供，原料去杂，鼓风干燥，打磨，过60 目筛，-20 ℃下保存；RPMI-1640 培养基（含胎牛血清），瑞士Roche 公司提供；水溶性四唑盐（WST-1），美国标准生物品收藏中心（ATCC），小鼠巨噬细胞；其余试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

离子交换色谱，加拿大戴安公司产品；R200 型旋转蒸发器，瑞士BUCHI 公司产品；HC-3514 型离心机，科大创新股份有限公司产品；EL-800 型酶联检测仪，美国BioTek 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 血耳子实体多糖的提取

血耳粉末按料液比1∶10 沸水浸提2 h，冷却，以转速4 000 r/min 离心15 min。取上清液，旋转蒸发仪浓缩，浓缩液按1∶4 乙醇沉淀，冰箱中4 ℃下过夜，离心取沉淀，经复溶、透析、冻干，得血耳多糖。

1.3.2 血耳子实体多糖化学组成分析

含糖量测定采用硫酸苯酚法，蛋白含量测定选用lowry 法，单糖含量测定采用离子交换色谱法[5]。

1.3.3 血耳多糖对癌细胞的抑制作用

取含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，于96 孔培养板上接种人胃腺癌细胞（AGS）、结肠腺癌细胞（DLD-1） 和子宫颈癌细胞（HLa） 悬液，每孔200 μL 培养24 h（5%CO2、37 ℃），弃上清液，加入不同浓度梯度的不含小牛血清的血耳多糖样品，培养48 h 后，加入WST-1，再培养4 h，于波长450 nm 处测定OD 值。癌细胞抑制率按照公式（1） 计算。

式中：As——试验组OD 值；

Ac——空白对照组OD 值。

1.3.4 血耳多糖对Raw264.7 的增殖作用

将巨噬细胞Raw264.7 和多糖溶液（100 μL） 放置于96 孔培养板培养72 h，于波长405 nm 处测定吸光度。采用WST-1 法分析增殖作用，免疫细胞增殖率按照公式（2） 计算。

式中：As——实验组OD 值；

Ac——空白对照组OD 值。

1.3.5 血耳多糖对Raw264.7 分泌NO 分泌量的影响

将巨噬细胞（浓度为1×106cell/mL） 接种于96 孔培养板中，待细胞贴壁后，弃上清液。添加不同浓度的TSP 溶液或LPS（1 μg/mL，阳性对照），继续培养。24 h 后取上清液，加入等体积的Griess试剂，避光下反应10 min，于波长540 nm 处测定吸光度。

1.3.6 血耳多糖对Raw264.7 免疫因子的影响

将不同浓度的多糖溶液及LPS 与巨噬细胞悬液混合，置于96 孔平板上培养48 h 后，用ELISA 试剂盒检测细胞上清液中的细胞因子（TNF-α、PGE2、IL-1β） 的表达量。每组多糖处理组为3 个重复。

1.3.7 血耳多糖对Raw264.7 免疫因子基因表达的影响

Raw264.7 中加入TSP 或LPS，置于24 孔细胞培养板中，培养18 h。收集细胞，用TRIzol 试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） 提取总RNA。以提取的RNA 为模板，用oligo-(dT) 20 primer 和Superscript III RT（Invitrogen hCarlsbad hCA hUSA） 制备cDNA，再用PCR 技术进行扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶图像处理软件扫描分析（Kodak Digital Science hKennesaw hGA hUSA）。

1.3.8 数据处理

应用SAS 8.0 软件分析，各试验组之间的差异用单因素方差分析（ANOVA） 和邓肯氏复极差（Duncan's multiple-range test） 法进行分析比较。

2 结果与分析

2.1 血耳多糖的化学组成

采用水提醇沉法提取血耳多糖，提取的血耳多糖含糖量为82.13%，含有少量蛋白（5.34%） 及灰分（6.05%），单糖组成表明，血耳多糖主要由葡萄糖（80.52%） 组成，含有少量半乳糖（19.48%）。Wang Zhaojing 等人[6]报道了血耳多糖TSPII 主要由甘露糖、木糖、半乳糖和葡萄糖组成，这主要是由于原料来源、提取纯化和检测方法不同。

血耳多糖的化学组成见表1。

表1 血耳多糖的化学组成/%

2.2 血耳多糖TSP 对小鼠巨噬细胞增率的影响

巨噬细胞在病原体和抗原的刺激下会启动免疫应答[7]。因此，试验以小鼠巨噬细胞Raw264.7 为细胞模型，考查血耳多糖对Raw264.7 免疫增殖及细胞因子分泌的影响，为血耳多糖的开发利用提供理论依据。结果表明，含有血耳多糖的培养皿中，细胞长势良好，培养基清澈。

TSP 对巨噬细胞Raw264.7 增殖率的影响见图1。

图1 TSP 对巨噬细胞Raw264.7 增殖率的影响

加入TSP 后，小鼠巨噬细胞增殖率提高，且增殖率随TSP 质量浓度增加而增加，具有质量浓度梯度关系，说明TSP 对小鼠巨噬细胞Raw264.7 无细胞毒性，可以促进小鼠巨噬细胞的增殖。

2.3 TSP 对小鼠巨噬细胞NO 的影响

TSP 对巨噬细胞Raw264.7 中NO 的影响见图2。

图2 TSP 对巨噬细胞Raw264.7 中NO 的影响

NO 的分泌是巨噬细胞激活的重要指标，抗癌抗病毒等功能通过释放NO 来实现[8]。TSP 对小鼠巨噬细胞分泌NO 的影响。由图2 可知，TSP 能显著提高小鼠巨噬细胞NO 的分泌，并呈现计量依赖关系。说明TSP 是免疫调节活性物质，具有免疫调节活性。

2.4 TSP 对小鼠巨噬细胞细胞因子分泌的影响

被激活的巨噬细胞能释放大量的细胞因子，如TNF-α、PGE2 等。细胞因子在免疫反应中起到了至关重要的作用，可以抗击炎症、抑制肿瘤等[9-12]。

TSP 对巨噬细胞中TNF-α 释放的影响见图3。

图3 TSP 对巨噬细胞中TNF-α 释放的影响

在添加TSP 后，巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、PGE2、IL-1β 较阴性对照明显增加（p＜0.01），且生成的细胞因子随TSP 剂量的增加而增加，呈剂量依赖关系。

TSP 对巨噬细胞中PGE-2 分泌量的影响见图4，TSP 对巨噬细胞中IL-1β 分泌量的影响见图5。

图4 TSP 对巨噬细胞中PGE-2 分泌量的影响

图5 TSP 对巨噬细胞中IL-1β 分泌量的影响

2.5 TSP 对小鼠巨噬细胞iNOS、COX-2 的影响

TSP 对巨噬细胞中iNOS mRNA 表达的影响见图6，TSP 对巨噬细胞中COX-2 mRNA 表达的影响见图7。

图6 TSP 对巨噬细胞中iNOS mRNA 表达的影响

图7 TSP 对巨噬细胞中COX-2 mRNA 表达的影响

iNOS 和COX-2 的表达由RT-PCR 方法检测获得。结果表明，小鼠巨噬细胞在与不同质量浓度TSP培养后，相对于阴性对照组，多糖组的mRNA 表达显著提高，并且呈现剂量依赖关系。结果表明，TSP促进小鼠巨噬细胞分泌NO 和PGE2 是通过iNOS 和COX-2 基因的表达完成的。

3 结论

沸水浸提法提取血耳多糖（TSP），TSP 对小鼠巨噬细胞Raw264.7 具有显著的刺激作用，具有免疫调节活性，可以作为免疫调节剂应用在食品和医药行业中。今后将进一步研究血耳多糖免疫活性的构效关系和免疫通路，以期为开发血耳多糖保健助剂提供基础理论依据。