腹腔注射葡萄糖对大口黑鲈血糖稳态和糖代谢关键酶活性的影响

廖 磊，刘 浩，赵柳兰，刘 巧，黄 瑞，刘昌勇，唐小鸿，胡一帆，杨 淞

(四川农业大学 动物科技学院，成都 611130)

糖类(碳水化合物)是鱼类的重要能源物质之一，饲料中添加适宜水平的糖有利于节约蛋白质，降低饲料成本，促进鱼类生长。但多数鱼类对糖的利用能力有限，特别是肉食性鱼类。大口黑鲈()是典型的肉食性鱼类，在中国和许多其他国家都是重要的养殖淡水经济鱼类。大口黑鲈的人工养殖受全球水产动物饲料生产趋势的影响，例如使用高水平的碳水化合物和脂肪以减少饲料中昂贵的蛋白质含量。为探求鱼类对糖类的利用能力，诊断人类糖尿病的糖耐量实验已被运用于多种鱼类的营养研究中，如鲤()、罗非鱼()和大黄鱼()等。研究发现大口黑鲈摄食高糖饲料会出现代谢紊乱、肝组织损伤和损害肠道健康等现象。因此，探讨大口黑鲈对葡萄糖的耐受能力具有一定的生产意义。

众所周知，葡萄糖的代谢包括分解代谢和合成代谢过程。鱼类消化吸收后开始从糖酵解途径利用膳食中的碳水化合物，并通过三羧酸循环产生能量。过量的葡萄糖也可能通过糖异生过程转化为糖原。在体内，能量代谢物(例如葡萄糖，丙酮酸和乳酸等)处于动态平衡状态，且受主要饲料营养成分调节；已经证明调节葡萄糖和脂质代谢途径的关键酶对饮食中碳水化合物的摄入有反应。因此了解高糖负荷是否影响葡萄糖转运过程和葡萄糖代谢酶的活性，是阐释大口黑鲈对糖利用能力必不可少的步骤。

本研究以大口黑鲈为研究对象，通过腹腔注射高浓度葡萄糖溶液，测定0～48 h过程中血糖浓度、肝脏和肌肉中糖代谢相关酶的活性和物质含量，并检测肝脏中葡萄糖转运相关因子的基因表达，以阐释大口黑鲈对糖的利用能力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用大口黑鲈购自眉山市洪氏水产养殖场，在实验室暂养2周后，挑选96尾健康、体质强壮、体质量(165.42±5.45)g的大口黑鲈作为试验鱼。使用0.8%生理盐水将分析纯葡萄糖溶解为400 mg/mL浓度的葡萄糖溶液用于腹腔注射，配置后经过高压蒸汽灭菌后，冷藏于4 ℃冰箱中备用。

1.2 试验设计与取样

将禁食24 h的96尾鱼随机分到容积为(120 cm×40 cm×21 cm)的6个水族箱内，对照组(C组)、实验组(G组)各设3个重复，每个水族箱16尾鱼。G组腹腔注射2 g/kg体重葡萄糖溶液；为了确保两个组的注射量相同，C组注射相同剂量的生理盐水。实验过程中水环境如下：温度，(20.0±0.5)℃；pH 7.5±0.2；溶解氧(DO)>(7.0±0.2)mg/L;氨氮和亚硝酸盐<0.02 mg/L。

在注射前(0 h)和注射后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h进行采样，每个时间点分别从C组和G组中各取6尾鱼，用MS-222(浓度为50.0 mg/L)麻醉后采取血液、肝脏和肌肉样品。血液样品先用肝素钠抗凝，室温静置30 min，再离心10 min(2 500 r/min)，收集上层血浆。肝脏和肌肉样品经液氮冷冻后转移至-80 ℃冰箱中保存待测。

1.3 生化指标测定

将-80 ℃保存的血浆、肝脏和肌肉组织于冰上解冻，肝脏解冻后加入9倍体积的0.8%预冷生理盐水(组织∶生理盐水=1∶9)，在1.5 mL离心管中使用碾磨器充分研磨，然后在4 ℃，2 500 r/min条件下离心10 min，取上清液进行检测。所有生化检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，并按照试剂盒的说明进行操作，利用酶标仪进行检测。测定指标及试剂盒货号见表1。

表1 生化检测试剂盒信息

1.4 RNA提取和实时荧光定量PCR

用动物总RNA提取试剂盒(Cat.No.re03011，福际生物，成都)从肝脏中提取总RNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。用RT EasyTM II(with gDNase)试剂盒(CAT No.Rt-01031，福际生物)将RNA逆转录成cDNA。使用real-time PCR试剂盒EASYTm-SYbr Green I(Cat.No.Qp-01011，福际生物)检测mRNA表达水平。本试验所用引物和定量PCR的步骤参照已发表的文章，引物信息见表2。目的基因用内参基因β-actin的几何平均值进行归一化，目的基因的相对表达量采用2法计算。

表2 荧光定量PCR引物信息

1.5 统计分析

实验数据以平均值±标准差的形式表示(=6)，利用SPSS22.0统计软件进行统计分析，先对数据作单因素方差分析(One-Way ANOVA)；若统计结果有显著差异，再进行Tukey进行多重比较，<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 大口黑鲈血糖、糖原和乳酸含量变化

在实验过程中，各组均无死亡。血糖水平变化如图1(a)所示，注射生理盐水的大口黑鲈血糖维持在一个较低且稳定的水平；而注射葡萄糖之后，大口黑鲈血糖水平随着时间推移呈先上升后下降的趋势，且在1～24 h的各个检测时间点均显著高于C组，直至48 h恢复至基础水平。肝脏和肌肉中糖原含量变化如图1(b,c)所示，C组和G组大口黑鲈肝糖原含量均现呈先上升后下降的趋势，但G组含量上升趋势较大且始终高于C组，在12 h和48 h时间点显著高于C组。两组的肌糖原变化趋势较小，且两组之间始终无显著差异。由图1(d,e,f)可知，注射葡萄糖后，血液、肝脏和肌肉中乳酸含量均发生了一定程度的升高；其中G组血液中乳酸含量在24 h和48 h时间点显著高于C组，肝脏中乳酸含量在1 h显著高于C组，肌肉乳酸含量持续升高且在24 h显著高于C组。

图1 注射葡萄糖对大口黑鲈血糖、糖原和乳酸含量影响

2.2 大口黑鲈糖代谢酶活性的变化

肝脏和肌肉中糖代谢酶活性变化如图2所示。注射葡萄糖后，肝脏和肌肉中糖酵解酶(HK和PK)活性都呈现了先上升后下降的趋势，并且在一些时间点显著高于C组。C组肝脏的PEPCK活性呈现先上升再下降的趋势，但变化幅度较小；G组肝脏的PEPCK活性在1 h显著上升，然后持续下降并且在12 h显著低于C组。由图2(f,g)可知，注射葡萄糖造成了肝脏和肌肉组织中Na-K-ATP酶的活性显著升高。

图2 注射葡萄糖对大口黑鲈糖代谢酶活性影响

2.3 大口黑鲈肝脏AMPKα和Glut基因的表达

大口黑鲈肝脏和基因的表达情况如图3所示。总的来说，C组和G组的相对表达量均呈现了先上升后下降的趋势；在2～24 h期间，G组的表达量几乎都低于C组，且在2 h具有显著差异。在注射后2 h至试验结束期间，G组Glut1的相对表达量始终低于C组，且在24 h差异显著。两组Glut4的表达量则先升高后降低，G组变化趋势高于C组，且在2 h达到最高。

图3 注射葡萄糖对大口黑鲈肝脏AMPKα和Glut基因表达的影响

3 讨论

3.1 注射葡萄糖对大口黑鲈血糖稳态和糖原积累的影响

不同鱼类利用膳食碳水化合物作为能量来源的能力各不相同，肉食性鱼类的利用能力一般低于杂食性和草食性鱼类。葡萄糖耐量试验被广泛用于评价鱼类利用碳水化合物的能力，而血糖水平是鱼体内糖代谢和生理功能状况的一个重要指标，能反映糖类吸收状况。本实验中，在注射之前，大口黑鲈被禁食24 h以恢复本研究中的基础血糖水平；同时，注射生理盐水后的大口黑鲈血糖水平变化较小，表明注射过程和时间变化对大口黑鲈血糖稳态的影响较小。注射2 g/kg葡萄糖的大口黑鲈血糖升高持续了24 h以上，在48 h时检测到恢复至基础水平。已有的研究显示，杂食性鱼类吉富罗非鱼()在腹腔注射2 g/kg葡萄糖后，高血糖持续6 h以上；暗纹东方鲀()在腹腔注1 g/kg葡萄糖后，高血糖会持续9 h。肉食性鱼类虹鳟()在腹腔注射1 g/kg和0.3 g/kg葡萄糖后，高血糖分别持续24 h和18 h；欧洲海鲈()在腹腔注射1 g/kg葡萄糖后血糖水平上升直到12 h恢复到基础水平。从血糖升高情况来看，本实验中血糖水平在8 h达到最大值，而其他鱼类上的研究显示，沙重牙鲷()在腹腔注射1 g/kg葡萄糖后血糖在2 h达到峰值。由此可知，与大多数肉食性鱼类一样，大口黑鲈糖耐受能力较差，对血液中葡萄糖的清除能力弱，从而表现为持续的高血糖。Na-K-ATP酶是一种水解酶，水解时释放能量，可推动细胞膜上葡萄糖载体的开动，推动葡萄糖等物质的跨膜运输。葡萄糖的运输虽然并不直接利用ATP，但间接利用Na-K泵产生的离子梯度所提供的能量进行协同运输，葡萄糖可利用离子梯度，通过专一的运输载体，伴随Na运输入细胞。本研究中，注射葡萄糖后肝脏中Na-K-ATP酶活力在除8 h外其他时间点均显著高于对照组，肌肉中除2 h和4 h外也都显著高于对照组。这表明大口黑鲈可通过增强Na-K-ATP酶活力来推动葡萄糖的跨膜运输，促进血液中葡萄糖进入组织，从而降低血糖。

通常，摄入后暂时未利用的葡萄糖也可以转化为糖原储存，其中肝糖原的合成与分解主要是为了维持血糖浓度的相对恒定，而肌糖原的合成与分解主要是为肌肉提供ATP。已有报道显示，鱼类在摄食高糖饲料之后，鱼体会表现出较高的肝糖原水平。对军曹鱼()和虹鳟等实验研究发现肝糖原含量先上升后下降，未引起肌糖原的明显增加。本研究发现，大口黑鲈在注射高浓度葡萄糖后，肝糖原含量逐渐上升至12 h达最高水平，然后开始下降，肌糖原变化不显著。这表明大口黑鲈在摄入高糖后能够将碳水化合物转化为肝糖原进行能量储存和代谢。在鱼类中，当组织能量物质没有通过有氧呼吸或氧不足发挥作用时，乳酸浓度会上升。研究表明，随着饲料中碳水化合物含量的增加，糖代谢会逐渐增强，产生更多的丙酮酸，不可避免地会消耗更多的氧气，从而造成无氧呼吸增加，乳酸含量增加。本研究中，注射葡萄糖后，肝脏乳酸含量在1 h显著增加，同时血液和肌肉中乳酸含量呈现了上升趋势，这表明葡萄糖负荷促进了大口黑鲈乳酸的生成。

3.2 注射葡萄糖对大口黑鲈糖酵解和糖异生酶活性的影响

鱼类同其他动物一样，糖酵解过程是其主要的葡萄糖代谢途径，HK和PK酶是糖酵解过程中的限速酶。本研究中，注射葡萄糖后，大口黑鲈肝脏和肌肉组织中两种酶的酶活性都呈现了先上升后下降的趋势。在其他鱼类上的研究显示，大黄鱼和鲤鱼在葡萄糖注射后，HK酶活性先增大后减少；罗非鱼注射葡萄糖后，HK酶活性没有显著变化；以上的结果表明了HK酶在糖酵解过程中的关键性地位，葡萄糖注射会提高HK活力。PK是促进丙酮酸生成的关键酶，研究表明饲料中碳水化合物的比例会对PK的活性具有一定的影响。青鱼()肝胰脏和肌肉部位中PK活性会随着饲料中糖类的增加而显著提高；鲤鱼在注射葡萄糖后血浆中的PK活性呈先上升后下降的趋势。本研究结果与以上报道基本一致，表明高糖负荷促进了大口黑鲈糖酵解酶HK和PK活性的上升，从而加强了糖酵解过程。

在健康的条件下，肝脏也可以通过抑制肝脏糖异生来处理葡萄糖负荷。PEPCK能催化草酰乙酸脱羧转变为磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的关键限速酶。多项研究表明糖尿病患者的肝脏糖异生关键酶PEPCK表达量均明显升高，这表明控制PEPCK酶活性对维持正常血糖水平有着重要意义。鱼类上的研究发现，暗纹东方鲀在注射葡萄糖后，PEPCK活性呈现不规律变化，在4、8 h显著升高，其余时间点无显著差异；葡萄糖注射对罗非鱼肝脏中PEPCK的表达和酶活性均未造成显著影响。与以上结果相似，本研究中注射葡萄糖的大口黑鲈肝脏PEPCK活性呈现无规律变化，在1、24 h显著升高，其余时间点均低于对照组但无显著差异，这表明大口黑鲈不能有效地处理葡萄糖负荷。以往研究也报道了肉食性鱼类不能有效调节其糖异生，这被认为是其糖耐量能力较低的主要原因之一。

3.3 注射葡萄糖对大口黑鲈葡萄糖转运的影响

AMP活化蛋白激酶(AMPK)是一种作为能量传感器的关键酶，当细胞中ATP/AMP比值降低时，该酶会被激活。作为营养感应传导分子，AMPK激活对糖代谢调节的影响是重要的，可调控葡萄糖吸收、糖原代谢、糖异生和脂肪生成过程。在大鼠肾小球系膜细胞发现，高糖孵育造成了其总AMPKα蛋白和磷酸化AMPKα蛋白表达水平均低。本研究中，注射葡萄糖造成了的mRNA水平下调，这可能是由于葡萄糖摄入后ATP生成量增加了，从而下调了基因表达。因为AMPK活化对营养代谢调节的总方向是抑制ATP消耗过程，促进ATP的生成反应。

肝脏和血液中葡萄糖浓度保持平衡是由于多种葡萄糖转运体的存在，它们介导了一个双向的、能量独立的葡萄糖转运过程。葡萄糖转运体(Glut)转移率的提高是AMPK发挥促进葡萄糖吸收的重要原因，Glut l和Glut 4在生物体中广泛分布，参与转运葡萄糖，其中Glut l被认为是种葡萄糖传感器。研究发现，当罗非鱼餐后血糖水平升高时，1～3 h肝脏1和2的表达均降低；另外的研究报道了罗非鱼肌肉中4 mRNA的相对表达量在注射葡萄糖后3 h开始升高,在12 h时达到最高。在本研究中，注射葡萄糖的大口黑鲈肝脏1 mRNA的表达水平始终低于对照组，4先升高后降低。因此，我们推测肉食性大口黑鲈4表达上调可能参与了肝脏葡萄糖转运，而被高糖水平抑制。

4 结论

总的来说，作为肉食性鱼类的大口黑鲈对葡萄糖的耐受能力较低，表现为对血液中葡萄糖的清除能力弱。在高糖负荷条件下，糖酵解过程被加强，也促进了乳酸和糖原的生成。然而糖异生途径的关键酶PEPCK活性不能被高浓度葡萄糖抑制，这可能导致内源性葡萄糖不断被合成而使大口黑鲈血糖持续偏高。此外，Na-K-ATP酶、AMPKα和Glut4可能参与了高糖负荷条件下的葡萄糖转运，这对血糖的稳态具有重要意义。