MrFoxl2-dsRNA对罗氏沼虾卵巢中foxl2及生殖相关基因表达的影响

祝远奎，陈鸿禄，魏怡飞，王卫民

(华中农业大学水产学院，动物遗传育种与繁殖重点实验室，武汉 430070)

罗氏沼虾()，隶属于节肢动物门(Arthropoda)十足目(Decapoda)长臂虾科(Palaemonidae)沼虾属()，是一种经济价值高的水产动物，其养殖区域广泛分布于孟加拉国、中国、印度、缅甸、泰国和越南等亚洲国家。在全球虾类养殖业中，罗氏沼虾的养殖量已跻身前三。随着罗氏沼虾养殖量的持续增长，由性早熟引起的生长缓慢与抗逆性差等种质衰退现象逐渐出现，并成为罗氏沼虾养殖过程中不可忽视的问题。因此，罗氏沼虾的生殖调控研究在其产业发展中有重要意义。

卵巢是许多激素产生与分泌的主要场所和众多激素受体的分布之处，如促性腺激素释放激素样肽、蜕皮激素受体与类视黄醇X受体，也是研究甲壳类动物生长和生殖相关基因的重要组织。许多研究表明，卵巢的发育受相关激素和基因的共同调控，包括促性腺激素释放激素样肽(-like peptides)、叉头框家族L2基因(2,L2)、卵黄蛋白原基因(,)、组织蛋白酶L基因(,)、蜕皮类固醇受体基因(,)与一些类固醇合成相关基因，如类固醇生成酶基因(3,17)与细胞色素P450家族基因(111,17与191)。2基因属于叉头框(Forkhead box,FOX)家族，是卵巢分化、发育和维持等发育过程的转录调节因子。2对卵巢的功能具有维持作用，在敲除2基因后，用黄体酮处理小鼠()的产后子宫可导致小鼠不孕。在鱼类2的研究中也取得了类似的结果，周运迪等在敲除青鳉()的2基因后发现青鳉的卵巢中出现了退化的卵母细胞，Yang等在敲除斑马鱼()的2基因后，发现斑马鱼卵巢的发育与卵子发生受到影响。此外2还与褐牙鲆()、施氏鲟()、乌鳢()等物种卵巢的发育有关。在克氏原螯虾()与中华绒螯蟹()中的研究结果显示，2仅在卵巢组织中高表达，并被认为可能参与了卵巢的发育。罗氏沼虾作为重要的水产经济物种，其卵巢发育研究意义重大，但关于罗氏沼虾2的研究仍未见报道。

本研究主旨是探究与分析罗氏沼虾2基因在卵巢发育过程中的功能。本研究比较分析了2(2)在性成熟前后罗氏沼虾肝胰腺与卵巢中的表达量变化，运用RNA干扰技术沉默了2基因，确定了干扰2基因的最佳注射剂量，并比较了在不同的2-dsRNA注射剂量下生殖相关基因的表达量变化。本研究为罗氏沼虾生殖调控研究提供了参考资料，同时也为罗氏沼虾养殖与育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

从华中农业大学水产养殖基地挑选健康、活力好的未性成熟罗氏沼虾(体重约为1.55±0.08 g)10只，与性成熟[未产卵(体重约为3.50±0.07 g)与产卵一次(体重约为19.65±1.36 g)]罗氏沼虾30只作为试验动物，在300 L的养殖桶内暂养一周后开始试验，水温控制在(28±0.5)℃，每日投喂4次虾用饲料，每三日更换1/3的水。

1.2 样品采集、总RNA提取与反转录

分别采集未性成熟与性成熟的罗氏沼虾的卵巢与肝胰腺并用于RNA提取。采用Trizol法提取样品中的总RNA，RNA的浓度由Nanodrop 2000(Thermo Scientific,USA)测定，并使用琼脂糖凝胶电泳评估所提取RNA的质量。反转录反应使用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa Bio Inc.，大连)试剂盒，总RNA的用量为1 μg，实验步骤按试剂盒说明书进行。反转录产物用灭菌水稀释后保存于-20 ℃冰箱。

1.3 Mrfoxl2在性成熟前后罗氏沼虾肝胰腺与卵巢中表达

挑选未性成熟与性成熟的雌性罗氏沼虾各6只，分别摘取肝胰腺与卵巢组织，经RNA提取与反转录后用于荧光定量分析，2在性成熟前后罗氏沼虾肝胰腺与卵巢中的表达量由Quanstudio 6 Flex仪器检测与分析。根据GenBank中所收录的2序列(GenBank accession No.MZ647492)，利用Primer3web version 4.1.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)在编码区设计了一对引物(F-qf1/R-qf1)用于荧光定量PCR(表1)，荧光定量PCR的程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s共 35 循环。每个样品做三个重复，利用2方法计算三个重复的平均值。

表1 本研究中所用的引物序列

1.4 RNA干扰MrFoxl2后生殖相关基因的表达量变化

1.4.1 dsRNA模板的制备

利用在线软件http://www.flyrnai.org/snapdragon在编码区内设计了一对引物(F-ds-f1/R-ds-f1)用于dsRNA的制备(表1)，从卵巢组织中提取总RNA并反转录成cDNA，使用F-ds-f1/R-ds-f1作为引物，以卵巢cDNA为模板进行PCR扩增，所得的PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行评估，PCR反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共 35 循环；72 ℃ 10 min。将符合预期的PCR产物切胶回收，DNA片段的回收与纯化使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒，经纯化后的产物保存于-20 ℃。

1.4.2 dsRNA的合成

以纯化后的PCR产物为模板，用F-ds-f1/R-ds-f1引物进行PCR扩增，PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，67 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共36 循环；72 ℃ 10 min。所获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳评估后进行切胶回收，利用HiScribeT7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB，USA)试剂盒，以切胶回收后的产物为模板合成2-dsRNA，所得产物由Nanodrop 2000(Thermo Scientific,USA)测定2-dsRNA浓度，并由琼脂糖凝胶电泳评估其质量与完整性。最后用MonarchRNA Cleanup Kit试剂盒对2-dsRNA进行纯化，用无酶水稀释纯化后的dsRNA并保存在-80 ℃。

1.4.3 dsRNA的注射

挑选16只卵巢发育正常且性成熟的罗氏沼虾[体重为(3.50±0.15)g]用于RNA干扰试验，分为1个对照组与3个处理组，每组包含4只雌虾，对照组与处理组的雌虾均在相同条件下饲养。对照组的雌虾注射无酶水，三个处理组的雌虾注射dsRNA的剂量分别为0.5、1与2 μg/g，注射部位均为第二腹节，注射24 h后采集所有雌虾的卵巢组织并迅速放入-80 ℃保存，RNA干扰2后卵巢中2、、与的表达量变化由Quanstudio 6 Flex仪器检测与分析,所用引物见表1。

1.5 统计学分析

所有实验数据的统计学分析由SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)软件完成，<0.05被认为有显著性差异，利用GraphPad Prism 8(GraphPad Software,California,USA)软件绘制荧光定量分析结果图。

2 结果与分析

2.1 性成熟前后MrFoxl2在肝胰腺与卵巢中的表达

2在罗氏沼虾性成熟前后卵巢中的表达量均显著高于肝胰腺，在未性成熟的罗氏沼虾卵巢中2的表达量为肝胰腺的3.8倍，在性成熟的罗氏沼虾卵巢中2的表达量为肝胰腺的9.5倍。2的表达量在性成熟前后罗氏沼虾肝胰腺中无显著差异，而性成熟后罗氏沼虾卵巢中2的表达量明显高于性成熟前(图1)。

图1 性成熟前后MrFoxl2在肝胰腺与卵巢中的表达

2.2 MrFoxl2-dsRNA的干扰效果验证和最适剂量探究

荧光定量PCR结果显示，在注射2-dsRNA干扰2基因后，2的表达量显著下降，由图2可知，注射不同剂量的2_dsRNA对2基因产生了不同的干扰效果，注射2_dsRNA的剂量为1 μg/g时对2基因的干扰效果最佳，随着注射剂量增加至2 μg/g，2_dsRNA对2基因的干扰效果反而减弱。

图2 不同MrFoxl2-dsRNA注射剂量下卵巢中MrFoxl2的表达

2.3 MrFoxl2沉默后生殖相关基因表达量的变化

在2沉默后，生殖相关基因与的表达量显著降低，而生殖相关基因的表达量显著提高(图3)。在注射2-dsRNA的剂量为0.5 μg/g时，与基因的表达量下降至最低，在注射剂量为1 μg/g时，2基因的表达量下降至最低，而与基因的表达量并未继续降低。在2沉默后，随着注射剂量从0.5 μg/g增加至1 μg/g时，基因的表达量继续升高。

图3 MrFoxl2沉默后生殖相关基因(VG、EcR and CatL)的表达

3 讨论

由于罗氏沼虾()的产卵周期较长，并且在人工圈养下的自然产卵相对不集中，致使育苗成本增加。眼柄消融是过去实现促进卵巢成熟的常用技术之一，但该方法造成的损伤导致了雌虾在眼柄摘除后存活率降低。因此，相比摘除整个器官，通过操控相关基因的表达调控卵巢发育似乎是一种更好的方法。

性成熟是生物发育过程中的重要节点，在性成熟前后生殖相关基因的表达水平会出现显著变化，方之平等发现性成熟后黄颡鱼()与鲇()卵巢中的(-)和(-)的表达量明显高于性成熟前，VON等发现在性成熟前后大西洋鳕()垂体中的1、2、()与(-)等基因的表达量有显著性变化。本研究对比分析了罗氏沼虾性成熟前后肝胰腺与卵巢中2的表达，发现性成熟后罗氏沼虾卵巢中2的表达量明显高于性成熟前，这显示2与罗氏沼虾的生殖活动关系密切。此外，性成熟前后2在卵巢中的表达量均显著高于肝胰腺，这与2基因在克氏原螯虾卵巢与肝胰腺中的表达模式类似。

2在一些哺乳动物和鱼类的卵巢发育中发挥了重要功能，但在甲壳动物中，2基因所发挥的作用仍然未知。RNA干扰是研究基因功能的重要手段，通过注射dsRNA研究基因功能在甲壳动物中已有诸多报道。本研究使用了不同剂量的2-dsRNA敲降2基因，发现1 μg/g的注射剂量对2基因的敲降效果最佳，并且2基因的敲降水平与2-dsRNA的注射剂量并未呈完全正相关，这与VENTURA等干扰(insulin-like androgenic gland)基因的研究结果类似。性腺的成熟依赖于卵母细胞中卵黄蛋白原的快速合成与积累，持续敲降基因会显著延迟卵巢的成熟。本研究通过注射2-dsRNA显著降低了2的表达水平，并且发现基因的表达水平随着2被敲降而显著降低，这表明2可能通过调控基因的表达从而参与卵巢的成熟过程，类似的结果在中华绒螯蟹中已被报道。在甲壳类动物中，卵巢中的表达量在卵巢成熟前达到顶峰，基因被认为介导了蜕皮类固醇刺激卵巢发育。本研究中RNA干扰2基因造成基因表达量的显著下降，这佐证了2可能参与卵巢成熟过程的推论。此外，随着注射剂量从0.5 μg/g增加至1 μg/g，2基因的表达量进一步降低，而与基因的表达量反而相对上升，推测可能存在一些基因对与进行正调控，并与2基因协同参与卵巢成熟过程。CatL是卵黄的水解酶，在昆虫与鱼类的卵巢发育中起着核心作用。当注射剂量为0.5 μg/g与1 μg/g时，基因的表达量显著下降，卵黄蛋白原的合成可能受到抑制，基因表达量的显著上升可能与机体保障卵巢发育有关，与基因表达量的负相关在Zhu等对日本沼虾()基因的研究中已被报道。在脊椎动物中的研究表明2可能与-1(-1)相互作用，共同调节细胞色素P450酶的转录并参与卵黄蛋白原的合成，根据本研究的结果推测，在甲壳类动物中2基因可能通过调控基因的表达从而影响卵黄蛋白原的合成。甲壳动物卵巢成熟的调节机制仍需更多的研究进行探索和发现。

综上所述，2在卵巢组织中高表达，并且性成熟后2在卵巢中的表达较性成熟前显著上升。RNA干扰2基因造成与基因的表达量显著下降，基因的表达量显著上升，这表明2可能在罗氏沼虾卵巢成熟过程中发挥了重要作用。