黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列克隆和报告基因载体活性分析

杜怡芳，朱信超，李贤慧，曲宪成

(上海海洋大学水产与生命学院/上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海/上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306)

鱼类在脊椎动物中分布最广且种类最多，与高等脊椎动物相比，鱼类性别决定机制更加复杂多样。脊椎动物的性别决定机制包括基因性别决定机制(GSD)、环境性别决定机制(ESD)和基因-温度性别决定机制(GSD+TE)。黄鳝()是由雌性到雄性的自然性逆转的温带淡水鱼，是性逆转研究机制的模式物种。相关研究报道显示下丘脑—脑垂体系统在诱发黄鳝性转变过程中发挥着重要的作用，也有学者在基因表达水平上对黄鳝性逆转进行了研究，如450、45011和1等性别相关基因表达量的变化对黄鳝的性逆转起着重要的调节作用。黄鳝性逆转的研究不仅对其发育机制起着非常重要的作用，也为进一步研究脊椎动物性别分化及生物进化提供重要的理论依据。

对于性别发育相关基因研究，基因家族一直以来都是重点研究对象之一。1参与许多动物的性别发育，是继后发现的一个与性别决定相关的重要基因，1在基因调控系统中扮演着重要角色。基因家族成员与性别决定基因和-3具有共同特征，其序列能编码一个与DNA特异结合的、且保守的蛋白功能区域，类似于锌指结构的保守基序。目前研究表明，基因家族参与了多种动物的性别发育。对于脊椎动物的相关报道显示，在多种脊椎动物中1基因功能的表达既有相似性又有特异性。HUANG等在黄鳝研究结果中报道了5个基因，即1，2，3，4和5，并利用黄鳝性腺，通过RACE技术克隆了黄鳝1的四个亚型，命名为1a，1b，1c和1d。通过实时荧光定量技术研究结果显示，1的四个亚型是通过不同方式剪接而成的，在性腺各时期都有表达，这表明1基因在黄鳝性别决定和分化中起着重要作用。

1在进化过程中具有高度保守性，有关报道显示1位于性别调控途径的上游，作为转录因子在雄性性腺分化、各种组织器官形成和功能维持中发挥重要调控作用。JIA等利用亚硫酸氢钠DNA测序技术研究了翘嘴鲌()1启动子在精巢和卵巢中的CpG甲基化模式，发现1的性别二态性表达受DNA甲基化调控，因此表观遗传修饰可能在翘嘴鲌的性腺分化中起关键作用。JEONG等发现细棘海猪鱼()GATAx和C/EBPa结合位点可以上调1基因的表达，Sox5蛋白可以下调1的表达。这些结果表明1基因在不同物种体内的调控作用机制会有所不同。

目前，对于黄鳝1基因5′端侧翼序列克隆的研究未见报道。本研究对黄鳝1基因的5′端侧翼序列进行克隆，对其进行测序分析，将构建的pGL3-enhancer-1报告质粒与海参荧光素酶内参质粒pRL-TK用Lipohigh转染试剂共转染至HEK293细胞，在转染32 h后，检测启动子双荧光素酶的表达活性，以期为后续揭示1基因对黄鳝性别分化转录调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

实验黄鳝购自于上海市临港新芦苑农贸市场，取黄鳝，切断颈椎将其处死，打开腹腔，每管收集约100 mg的肌肉组织，-80 ℃保存备用。由上海海洋大学实验动物伦理委员会的批准进行相应实验。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒、增强型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；DH5细胞购于天根生化(上海)有限公司；DNA聚合酶、I、I酶等购自Takara工程(上海皓嘉)有限公司；Lipohigh脂质体转染试剂购于生工生物工程(上海)有限公司；DMEM和Opti-MEM培养基购于赛默飞科技(中国)有限公司；双荧光检测试剂盒购于翊圣生物(上海)有限公司；pGL3-enhancer报告基因载体、pRL-TK内参质粒及HEK293细胞由上海海洋大学免疫学实验室张庆华教授惠赠；本次实验所有的引物合成及测序在生工生物工程(上海)有限公司进行。

1.3 黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列的克隆

运用基因组DNA提取试剂盒对黄鳝肌肉组织进行DNA提取，并根据黄鳝1基因组序列设计引物：上游5′-3′引物GGGGTACCATTAGAATATCGTGGACAAAAATTATTTC；下游5′-3′引物GCGAGCTCAGTCCAGCACCTGCTTGCGCTGCTTGTC。以黄鳝基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：模板DNA，1 μL；10×扩增缓冲液，5 μL；dNTP MIX，1 μL；上、下游引物，各2 μL；DNA聚合酶，1 μL；补加无菌去离子水至50 L。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；经94 ℃ 15 s，退火60 ℃ 30 s，72 ℃延伸4 min，共40个循环；72 ℃彻底延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，最后目标片段经增强型DNA回收试剂盒进行割胶纯化。

1.4 黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列中转录因子结合位点的预测分析

利用TESS-Transcription Element Search System在线数据库：https://www.cbil.upenn.edu/tess对黄鳝15′端侧翼序列进行预测分析5′端侧翼序列中的转录因子结合位点。

1.5 黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列构建到pGL3-enhancer载体

将回收纯化的1 PCR产物和报告载体pGL3-enhancer同时进行双酶切，两个酶切位点分别是Kpn I和Sac I。对酶切产物和pGL3-enhancer载体进行割胶回收，利用T4 Ligase连接酶对回收的PCR产物和报告载体pGL3-enhancer酶切产物进行16 ℃过夜连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5中37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆进行菌液PCR鉴定后筛选阳性克隆送至上海生工生物公司测序，将测序正确的菌液经质粒提取得到pGL3-enhancer-1重组质粒，最后对其双酶切鉴定。

1.6 双荧光素酶报告基因检测

HEK293细胞培养于10% FBS-DMEM培养基，设置培养箱内的参数为37 ℃，5% CO，每两天传代1次。在转染前的24 h左右，将细胞接种于24孔细胞培养板，接种密度约为1×10/孔，汇合率达到80%～90%即可进行转染，转染过程参照Lipohigh脂质体高效转染试剂说明书，每孔中的比例为DNA∶Lipo=1∶3，将100 ng目标质粒(pGL3-enhancer和pGL3-enhancer-1)和10 ng内参质粒pRL-TK共转染至HEK293细胞。转染32 h后，进行启动子报告基因双荧光素酶活性鉴定，计算出Firefly Luciferase与Renilla Luciferase的比值。转染时细胞处理分为空白对照组pGL3-enhancer质粒和实验组pGL3-enhancer-1重组质粒。每次实验设3个复孔，每组实验重复3次。

1.7 数据分析

采用Graphpad Prism5软件分析数据，单因素方差检验数据，以平均值±标准误(Means±SEM)表示。当<0.001时，表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 Dmrt1 5′端侧翼序列的克隆

以黄鳝基因组DNA为模板，根据NCBI数据库获得的1基因组序列设计引物，PCR产物经电泳检测，扩增的条带与目标条带大小一致。1 5′端侧翼序列中的大小为1 500 bp左右(图1)。

图1 Dmrt1基因5′端侧翼序列扩增片段

2.2 黄鳝Dmrt1 5′端侧翼序列转录因子结合位点预测

利用TESS-Transcription Element Search System在线数据库进一步对潜在的转录因子结合位点进行分析显示：克隆所获得的1 519 bp黄鳝1基因5′端侧翼序列中存在多个转录因子反应元件，如Oct-1、GATA-1、Sp1、Pit-1a和TBP等结合位点(图2)。其中，GATA-1、SRY、Oct-1和SP1家族蛋白和C/EBPalp的转录因子结合位点出现频率较高。这些转录因子可能对黄鳝1基因的表达产生影响。

图2 黄鳝Dmrt1基因5′端侧翼序列及功能反应元件

2.3 黄鳝pGL3-enhancer-Dmrt1 5′端侧翼序列双酶切鉴定

pGL3-enhancer-1 5′端侧翼序列经Kpn I和Sac I双酶切后电泳，分别得到5 000 bp左右载体片段和1 500 bp左右目的片段。其大小与预期条带一致。经测序证实，黄鳝1 5′端侧翼序列正确，亦证明了构建的双荧光素酶重组报告质粒正确(图3)。

图3 重组质粒pGL3-enhancer-Dmrt1双酶切鉴定

2.4 黄鳝pGL3-enhancer-Dmrt1 5′端侧翼序列双荧光素酶的检测

将pGL3-enhancer质粒和构建的pGL3-enhancer-1重组质粒分别转染至HEK293细胞，双荧光素酶检测实验结果显示，pGL3-enhancer-1质粒转染实验组的相对荧光素酶活性表达极显著高于对照组pGL3-enhancer质粒的活性表达(图4)。表明构建的pGL3-enhancer-1报告基因载体具有强启动活性。

图4 重组质粒pGL3-enhancer-Dmrt1转染HEK293细胞后荧光素酶相对表达量

3 讨论

为解析黄鳝性别分化相关作用机制，众多学者在黄鳝性别决定和性别分化的关键基因方面作了许多的研究。有研究显示，将1基因导入带有性染色体XX的雌性青鳉()，可以使遗传雌性体表现出雄性特征，诱导雌性发生性转化。1基因在鱼类中的表达也具有组织特异性，如黑鲷()1基因只在精巢中表达，在成熟精巢中表达水平较高；与黑鲷一样，半滑舌鳎()中1基因仅在成熟雄性的精巢中特异表达，而在其它组织中不表达；大口黑鲈()1基因在成熟鱼的精巢中表达量高，而在心脏、肝脏、大脑等其他组织中表达量弱，并在不同时期的雌雄性腺中表现出性别二态性，且在雌鱼中表达量很低，随着卵巢成熟逐渐降低。对半滑舌鳎的研究结果显示1转录激活因子样效应核酸酶能有效地诱导该基因的突变，通过构建1-TALEN质粒，并显微注射半滑舌鳎胚胎，诱导了1基因突变，导致半滑舌鳎精巢严重退化，出现卵巢样结构。在尼罗罗非鱼()中，1基因仅在雄性输精管支持细胞和上皮细胞中特异性表达，而雌性个体中不表达，雄激素用于诱导XX尼罗罗非鱼性逆转时，生殖细胞周围细胞中1基因的表达增加。其他鱼类在雄性和雌性个体中也有1基因表达，如斑马鱼的1基因在精巢和卵巢中表达，经过组织切片和原位杂交发现1基因在精巢和卵巢的生殖细胞中表达，表明1基因不仅参与斑马鱼的精巢发育，也可能参与斑马鱼的卵巢分化；大西洋鳕()1基因在精巢的生殖细胞中表达，其表达水平在精子发生过程中最高；虹鳟()1基因的表达水平在已分化的精巢中较高，但在卵巢中也有表达。因此，对于雌雄异体的鱼类中，1基因的表达与雄性性腺发育和性别分化密切相关。雌雄同体鱼类1基因表达水平的变化与精巢的发育有关，相关研究显示，黄鳝的1基因在精巢发育与精子形成过程中起着重要作用。

随着生物技术的发展，基因功能不仅需要通过实验进行验证，还需要通过生物信息数据进行整合分析，通过各种生物信息学软件进行预测。不同的预测软件基于不同算法的基础，每个软件由于条件有限，都有一定的局限性，因此，需要使用各种合适的分析和预测软件，整合各软件获得的数据，提高数据预测的正确性，为进一步的实验奠定坚实的基础。基因的5′端侧翼序列中存在作为基因表达调控中重要的顺式作用元件，在基因表达调控网络中有大量信息，需要对基因5′端侧翼序列的结构有一定的认识，基因5′端侧翼序列中的转录因子结合位点会影响基因的转录活性，因此，对基因5′端侧翼序列的分析、结合位点的识别及不同物种基因5′端侧翼序列差异性的研究对于基因调控具有重要的现实意义。而pGL3-enhancer是一种不含启动子的表达载体，具有氨苄抗性和双荧光素酶(萤火虫荧光及海肾荧光)，且具有灵敏度高，易检测等特点，广泛应用于硬骨鱼类基因5′端侧翼序列活性分析的研究。当启动子片段插入载体后，经转染细胞系后进行表达检测，当启动子片段表达转录活性时，它将驱使双荧光素酶报告基因的表达，从而产生不同于正常值的荧光。众多学者利用该方法检测基因启动子的活性。

HE等克隆了四川裂腹鱼()1 1 215 bp启动子，并对其核心调控区域进行了分析，测序结果显示四川裂腹鱼1基因启动子中存在正调控和负调控区域，同时表明其甲基化水平存在性别差异，另外1的表达与其启动子CpG甲基化显著负相关。本试验通过TESS-Transcription Element Search System在线数据库对潜在转录因子结合位点进行预测显示，黄鳝1基因启动子序列中存在的结合位点，如：AP-1、Oct-1和C/EBPa等真核生物通用的转录因子结合位点以及与性别相关基因的蛋白结合位点，如：SRY、Sox3和Sox5等。BOYER等的研究表明，不同物种的1基因5′端侧翼序列具有很大的同源性，通过比较人、猪和小鼠的基因5′端侧翼序列，表明它们在转录起始位点上游1 000 bp至3 000 bp左右具有多个保守性超过60%的调控区。其中，近端调控区主要包含Sp1、Sp3和Egr1等一些通用的转录因子的潜在结合位点，远端调控区包含几个Gata因子结合位点。在许氏平鲉()1基因5′端侧翼序列中有许多作用元件与3和9基因相同，如Oct-1、GATA-3、FOXD3和AP-1等转录激活蛋白结合位点，以及与性别相关基因的蛋白结合位点，如：Sox5、Sox9和SRY等，而SRY和Sox5结合位点与1基因的调控机制在鱼类中已有报道。此外，在许氏平鲉1基因5′端侧翼序列中，预测了C/EBPa、STATx和GATAx等结合位点。GAO等在斑马鱼1基因近端5′端侧翼序列中存在Sox5蛋白的结合位点，且证明Sox5蛋白能抑制1的表达。

本试验成功克隆了黄鳝1基因5′端侧翼1 519 bp序列，构建了1基因5′端侧翼序列报告基因表达载体，利用双荧光素酶报告基因检测实验证明了该基因5′端侧翼序列具有极显著的启动活性。并通过对黄鳝1基因5′端侧翼序列分析、结合位点的识别，为进一步研究其相关转录因子和调控功能奠定理论基础。而许多功能是通过转录因子之间相互协调发挥作用的，在今后的试验研究中，仍需通过构建的重组质粒pGL3-enhancer-1报告载体进行定点突变、缺失，以及染色质免疫沉淀等方法，对预测的转录因子结合位点的作用机制进行深入研究。