埃洛石纳米管负载香芹酚及其性能的研究

梅 军，王江丽，白 越，陈 龙，李富明，郑华明

（武汉工程大学 材料科学与工程学院，武汉 430205）

0 引言

近年来，活性包装系统因其能够有效防止微生物对新鲜食品的破坏，极大地延长食品的货架寿命，而成为人们关注的焦点［1-3］。目前在食品工业中常见的抗菌包装技术是将非挥发性的抗菌剂如：纳米Ag、多肽、TiO2、季铵盐等加入到包装材料中［4-7］，或者直接在食品中添加D-异抗坏血酸钠、山梨酸钾等，以此达到抑制细菌的生长或消灭细菌的目的［8-10］。此过程中只有当抗菌剂从包装材料的芯层迁移至表面，并且与食品充分接触时才能起到一定的抗菌效果。对于一些具有挥发性的抗菌剂，可以在容器的顶空弥漫在食品的周围，并与微生物充分接触，起到更加高效的杀菌效果［11］。植物精油因其具有超强的抗菌性、抗氧化性、安全性和挥发性，已在食品工业中得到越来越多的应用［12-13］。

植物精油的水溶性比较差，将其通过乳化的方式均匀地分散在水相中，可制备成抗菌乳液或者抗菌纳米乳。ROBLEDO等［14］首先制备了油包水型的百里香酚纳米乳，当百里香酚含量为110 ppm时，乳液对葡萄孢菌有很好的抑制效果。CRISTINA［15］等将植物精油直接加入到热塑性木薯淀粉/壳聚糖混合物中，以热压成型的方式成膜，研究发现在热处理过程中精油因受热流失，所制备薄膜的抗菌效果非常有限。LAURA等［16］把香柠檬油、葡萄柚和香芹酚（CA）混合精油（质量比3：1：1）包封在β-环糊精里，再混入到碎冰中，发现50（mg混合精油/kg碎冰）对海鲤鱼起到很好的保鲜作用，2 ℃的冷链贮存条件下，其保质期由以前的13 d延长到17 d。由此可见，CA被广泛用作抗菌剂用于食品保鲜中，但关于CA在制备薄膜过程中热稳定性的相关研究较少。

埃洛石纳米管（HNTs）是一种天然硅铝酸盐粘土矿物质，具有独特的中空管状结构，非常适合作为纳米容器，负载药物、抗菌剂等以达到药物传递和控制释放等目的［17-18］。本文以CA为抗菌剂，采用便捷、高效的循环负压法［19］制备香芹酚-埃洛石纳米管包合物（CA-HNTs），分别通过FTIR、TEM、TG、UV光谱仪和DSC系统分析包合物的成份、微观结构、载药率及热稳定性，并对其在不同温度下的储存稳定性及抗菌性进行研究。

1 试验部分

1.1 材料与设备

埃洛石纳米管（纯度90%，湖北省丹江口）；香芹酚（纯度99%，上海麦克林生化科技有限公司）；蛋白质含量为95%（w/w）的玉米醇溶蛋白（北京索莱宝科技有限公司）；大肠杆菌ATCC25922菌株，金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株（江西省人民医院）；Lambda35型紫外分光光度计（Perkin Elmer）；Nicolet 6700型傅里叶红外光谱（Thermo Fisher）；DSC-60型差示扫描热量仪（日本岛津）；STA 409 PC型综合热分析仪（NETZSCH）；JEM-2100型透射电镜（日本电子株式会社）；ZWY-2102C型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 埃洛石纳米管的提纯和酸化处理

HNTs的提纯：参照文献［20］的方法，将HNTs缓慢加入到去离子水中配制成10%（w/w）悬浮液，再加入0.05 %（w/w）六偏磷酸钠，60 ℃加热搅拌30 min，4 000 rad/min离心作用10 min，分离得到HNTs，再用去离子水洗涤3次，80 ℃干燥5 h后，研磨过筛备用。

HNTs的酸化处理：参照文献［21］的方法，将2.0 g提纯后的HNTs分散到100 mL 质量分数为10%（w/w）的硫酸溶液中，70 ℃下搅拌32 h。反应结束后8000 rad/min离心作用10 min，收集沉淀并用去离子水洗涤至中性，50 ℃真空干燥12 h，研钵后过80目筛保存备用。

1.3 香芹酚-埃洛石纳米管包合物的制备

采用负压法负载CA［22］：将HNTs按照0.1 g/mL比例与CA混合，冰浴环境下160 W功率超声处理20 min后，置于真空干燥箱中，在0.1 MPa的真空条件下保压30 min，然后打开真空阀门，使CA进入到HNTs管腔内。整个负载过程重复3次，负载结束后，6 000 rad/min离心作用10 min，并用无水乙醇洗涤掉HNTs表面的CA，再将负载CA的HNTs粒子在室温下风干15 h。

1.4 香芹酚标准曲线绘制

用无水乙醇配制1.0 mg/mL的CA溶液，再分别稀释至 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL。用紫外分光光度计测量276 nm处的吸光度值并绘制标准曲线。

1.5 香芹酚-埃洛石纳米管包合物的表征

1.5.1 香芹酚-埃洛石纳米管包合物载药率的测定

采用超声破碎法测定CA-HNTs的载药率［23］：称取0.1 g CA-HNTs，用10 mL无水乙醇室温浸泡30 min；设置超声破碎仪功率为90 W，破碎30 min；5 000 rad/min离心作用10 min。取一定量上清液定容至25 mL，测定276 nm处的吸光度，根据CA标准曲线计算包合物中的CA含量。载药率计算公式：

式中 m1——包合物中CA质量，g；

m2——包合物总质量，g。

1.5.2 香芹酚-埃洛石纳米管包合物的FTIR分析

采用溴化钾压片法测定样品的红外光谱。将风干的包合物与溴化钾以1：100比例进行混合，然后用玛瑙研钵研成均匀粉末。扫描条件设置为光谱范围4 000～400 cm-1，扫描次数64次，分辨率为4 cm-1。用溴化钾压片作为空白对照。每个样品的光谱采集在相同条件下重复3次。

1.5.3 香芹酚-埃洛石纳米管包合物的TEM分析

取0.1 g包合物加入到10 mL去离子水中，超声处理20 min后静置，取上清液滴到铜网上，在红外灯下干燥，测试电压为300 kV。

1.5.4 香芹酚-埃洛石纳米管包合物的TG分析

利用TG分析研究CA的载药量，称取3～5 mg样品于氧化铝坩埚中，在氮气氛围下，设定温度区间为30～800 ℃，升温速度为20 ℃/min。

1.5.5 香芹酚-埃洛石纳米管包合物的DSC分析

利用DSC分析研究CA-HNTs的热稳定性。称取5 mg左右的样品放置在铝制样品盒中密封，铝盒中央扎孔，以密封空铝盘作为空白对照。升温速率为10 ℃/min，氮气的流动速度为20 mL/min。HNTs和CA-HNTs的温度范围为25～450 ℃，CA的温度范围为25～150 ℃。

1.5.6 香芹酚-埃洛石纳米管包合物抗菌性能的研究

将2 g玉米醇溶蛋白加入到80%（v/v）的乙醇-水溶液中，常温搅拌1 h，取一定量的CAHNTs加入到玉米醇溶蛋白溶液中，再加入0.8 g的油酸，0.02 g的戊二醛，40 ℃搅拌2 h后，真空脱泡，流延成膜。参照文献［24］的方法，用平板计数法检测CA-HNTs包合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。首先，将接种后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在液体培养基中活化培养24 h，并将菌液稀释至105～106 CFU/mL；然后，把经过彻底灭菌后的6 mm的薄膜圆片放入稀释好的菌液中，摇床培养24 h后，稀释至合适的浓度，涂平板，计数菌落数并计算抑菌率。抗菌薄膜中CA-HNTs包合物的添加量分别为0%、2%、4%、6%、8%，以不加抗菌薄膜（纯菌液）的样品为空白对照。抑菌率计算公式：

式中 Y ——抑菌率；

A ——纯菌液的菌落数；

B ——抗菌薄膜样品的菌落数。

1.5.7 香芹酚-埃洛石纳米管包合物在不同温度条件下的缓释性能

称取3份质量为1 g的CA-HNTs，分别置于50 mL离心管中。将离心管分别放在5，25，40 ℃控温环境中，每12 h开盖换气1次，利用紫外分光光度计分别测量第 0，5，10，15，20，25 d 包合物中CA的保留率。

2 结果与讨论

2.1 香芹酚标准曲线

在276 nm处测一定浓度梯度的香芹酚-乙醇标准溶液的吸光度值，绘制CA标准曲线如图1所示。

图1 CA紫外标准曲线Fig.1 UV standard curve of CA

得香芹酚-乙醇溶液的标准曲线：y=14.39x+0.006 1，R2=0.999 62。式中x为CA的浓度，y为CA在276 nm处的吸光度值。通过标准曲线测得CA-HNTs中CA的载药率为20%。

2.2 FTIR分析

图2是CA、CA-HNTs和HNTs的红外谱图。可以看出，HNTs在高频区3 694 cm-1处出现较强的分裂吸收峰，是HNTs的Al-OH基团羟基伸缩振动和铝氧八面体与硅氧四面体之间的Si-OH基团羟基伸缩振动［25-26］，3 620 cm-1处是 HNTs的羟基的特征吸收峰。在3 448 cm-1处出现的宽峰是酸腐蚀HNTs产生的大量-Si-OH-弯曲振动引起［27］。在中频区，1 633 cm-1处是水分子的弯曲振动峰［28］。在低频区，1 093 cm-1和1 029 cm-1处的峰是-Si-O-键的伸缩振动谱带［29］。CA在高频区3 383 cm-1处的宽峰和2 960 cm-1处的窄峰分别是-OH和C-H的伸缩振动峰。在中频区，1 620～1 420 cm-1处的连续窄峰为芳香环C-C的伸缩振动，1 252 cm-1处为芳香环C-O伸缩振动峰［30-34］。

图2 CA、CA-HNTs和HNTs的红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of CA，CA-HNTs and HNTs

HNTs负载CA后具有原始HNTs的特征峰，并且与原始HNTs相比，在1 456，2 961，1 420 cm-1处可以观察到3个新峰，分别是C-H和C-C伸缩振动。CA-HNTs在1 295～1 095 cm-1处没有吸收峰，可能是CA在此区间吸收峰被HNTs所屏蔽，HNTs成功负载了CA。

2.3 TEM分析

图3为CA、HNTs和CA-HNTs的透射电镜图。

图 3 HNTs（a，b，c），酸处理后的 HNTs（d，e，f）和CA-HNTs（g，h，i）的 TEM 图Fig.3 TEM images of HNTs（a，b，c），acid-treated HNTs（d，e，f） and CA-HNTs（g，h，i）

从图3（a）可以看出HNTs为中空管状结构，尺寸大小比较均一。管长1 000～1 500 nm，管外径50～70 nm，其尺寸大小与文献报道基本一致［21］。图3（b）显示纳米管的管端为开口结构，这为液体状的CA能够被负载进纳米管提供了可能性。从图3（c）可以看出纳米管的表面存在凹坑结构。经酸处理后的HNTs在尺寸上并未发生明显的变化，从图 3（e）和图 3（f）可见，纳米管的内部沿轴心方向出现明显的虚影，这可能是硫酸与HNTs内部的铝酸盐产生了化学反应，使其内部孔道扩大。另外，HNTs的表面出现了微微隆起，结构变得更为蓬松，可见硫酸对HNTs外部的硅酸盐也产生了部分侵蚀作用。如图3（h）和图3（i），经负载CA后，HNTs内部的虚影及表面的隆起结构消失，CA在循环负压的作用下已填满HNTs内部管道及表面的微孔。

2.4 TG分析

图4表示的是HNTs、CA-HNTs和CA的TG曲线。从图中可以看出HNTs主要失重温度区间是400～600 ℃，主要是HNTs中羟基的脱水所产生的质量损失［35］。然而，HNTs负载CA后，包合物表现出2个失重阶段：第一阶段失重温度区间为100～211 ℃，主要是包合物中CA的挥发［36］；第二阶段为HNTs结构羟基的脱水，失重温度范围为400～600 ℃。结合图3（c）可以看出，HNTs成功负载了CA，在211 ℃时包合物的质量损失约为16%，这与紫外分光光度计所检测的CA-HNTs中CA的载药率为20%基本一致。

图4 HNTs，CA-HNTs和CA的TG曲线Fig.4 TG curves of pure HNTs，CA-HNTs and CA

2.5 DSC分析

图5分别是CA、HNTs和CA-HNTs的DSC曲线。从图5（a）可以看出CA在110 ℃有较宽的吸热峰，这对应于CA的热挥发过程［37］。从图5（b）可以看出HNTs和CA-HNTs在80 ℃附近都有较小的吸热峰，这可能是由于粒子表面少量吸附水的蒸发。CA-HNTs在172 ℃有明显的吸热峰，这可能是HNTs管腔内CA的挥发及沸腾共同所致。CA在常压下沸点为237 ℃，在负载CA的过程中，由于超声和负压的作用，使HNTs局部堵塞，管腔内部存在一定的真空度，使CA的沸点降低。在280 ℃左右，包合物的曲线上出现了放热峰，其原因可能是密闭的HNTs中的CA分解产生。由此可见HNTs的包覆，给CA提供热保护屏障，提高了CA的热稳定性［38］。

图5 CA、HNTs和CA-HNTs的DSC曲线Fig.5 DSC curves of CA，HNTs and CA-HNTs

2.6 香芹酚-埃洛石纳米管包合物抗菌性能研究

图6和图7为含CA-HNTs的抗菌薄膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。从左至右，分别为纯大肠杆菌菌液以及膜中CA-HNTs添加量依次为0%，2%，4%，6%，8%。从图中可以看出随着薄膜中CA-HNTs添加量的增大，菌落数逐步减少，表明抗菌薄膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果；当不添加CA-HNTs时，纯薄膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌也有一定的抑菌效果，其抑菌率分别为14%和7%，这主要是因为玉米醇溶蛋白薄膜中的交联剂戊二醛有一定的抗菌效果。当包合物添加量从2%增加到8%时，抗菌薄膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用显著提高。包合物添加量为8%时，对大肠杆菌的最大抑菌率为85%，对金黄色葡萄球菌最大抑菌率为59%，这主要是因为CA对大肠杆菌抑菌效果强于金黄色葡萄球菌［39］。

图6 抗菌薄膜对大肠杆菌的抑菌效果Fig.6 The antibacterial efficacy on Escherichia coli

图7 抗菌薄膜对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig.7 The antibacterial efficacy on Staphylococcus aureus

2.7 香芹酚-埃洛石纳米管包合物在不同温度中的释放

CA作为一种小分子，在空气中极易挥发，其活性成分易丧失。从图8中可以看出，在较低的温度条件下（≤25 ℃），随着储存时间的延长，包合物中CA的保留率下降很少，25 d后的保留率约为80%。当温度升高到40 ℃，存储25 d后，包合物中CA的保留率为66.2%，这主要是因为温度越高，HNTs中CA气体所产生的气压越大，CA的布朗运动加剧，对HNTs管壁的破坏增大，导致管壁产生微小裂缝，从而加速CA的逸出［40］。包合物中CA在刚开始的0～5 d内释放速率较快，可能是释放初期存在突释过程。存储20 d后，CA释放速率有所放缓。相较于纯CA常温下置于空气中极易挥发的特点，通过HNTs将其包覆，可以明显起到一定的缓释作用。

图8 CA-HNTs在不同温度下的保留率Fig.8 Retention property of CA-HNTs at different temperatures

3 结语

通过循环负压法，HNTs可以负载CA，其载药率约为20%；当CA-HNTs的添加量为8%（w/w）时，所制备的玉米醇溶蛋白薄膜具有良好的抗菌性能，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最高抑菌率分别为85%和59%；升高温度加快了CA从HNTs管腔内逸出速度，常温下储存25 d后包合物中CA的保留率最大为85.3%。CA-HNTs具有一定缓释抗菌效果，可应用于活性包装系统，提高食品的货架期。