非洲鸵鸟粪便中大肠杆菌的分离与鉴定

徐东杰，王家乡，李 鹏，谢 洋，皮劲松，吴 艳

（1.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064）

非洲鸵鸟（Struthio camelus），属鸵形目鸵鸟科鸟类，是目前现存鸟类中体型最大的、惟一的二趾鸟类，原生活于阿拉伯沙漠和非洲稀树林地带、沙漠草地［1，2］。鸵鸟全身都是宝，鸵鸟肉中蛋白质、钙、铁和锌的含量远比牛肉高［3］，具有特别高的经济价值［4］。鸵鸟的皮美观柔软、舒服耐用、透气性能好，是目前世界上鸵鸟养殖的重要产品［5］。鸵鸟皮加工后也可用于中高档服饰产业［6］。鸵鸟蛋用途多，不仅能够食用［7］，还能够做成装饰品［8］。

大肠杆菌为两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌，大多数大肠杆菌有鞭毛，可以运动，无荚膜、无芽孢。大肠杆菌是引起禽类患病最常见的病原菌［9］。根据致病特点可将致肠道疾病的大肠杆菌分为6类：肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠黏附性大肠杆菌（EAEC）和弥散黏附性大肠杆菌（DAEC）［10］。从流行病学上来说，大肠杆菌具有流行范围广、传播速度快等特点，可引起禽类全身各种疾病。该细菌既能水平传播也能垂直传播，水平传播可通过消化道、呼吸道、交配等途径，垂直传播则是通过种蛋污染［11］。从临床诊断学来看，致病性大肠杆菌主要临床表现为全身性的急性败血症、气囊病、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、肠炎等多种症状。单独感染致病性大肠杆菌时根据致病菌的毒力大小、禽本身健康状态，发病率、死亡率都有所差别，毒力强则发病率、死亡率高［12］。从病理学上来说，通常感染大肠杆菌病后实质器官会有出血点并变肿，肝脏颜色转为土黄色或绿色，同时伴有腹膜炎、肠炎等各种炎症。大肠杆菌可与其他病原菌混合感染而加重病情，致使禽大肠杆菌病不能得到有效防控，给禽养殖产业造成了严重的经济损失［13］。

本研究通过微生物鉴定方法从鸵鸟粪便中分离出大肠杆菌菌株并进行镜检，将分离9株大肠杆菌与其他文献中致病性大肠杆菌的生化特性对比，利用生化特性鉴定大肠杆菌，对大肠杆菌病原学分类研究具有一定参考价值，为下一步研讨大肠杆菌生物学特性奠定好前期基础，为寻找致病性大肠杆菌做准备，为大肠杆菌疾病的诊断、医治提供理论依据，以减少养禽业的经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样本采集长江大学鸵鸟研究所中9羽（5只雌性、4只雄性）日龄、体况相近的非洲鸵鸟的粪便作为研究对象。

1.1.2 试剂与仪器恒温振荡培养箱、酒精灯，常州亿通分析仪器制造有限公司；光学显微镜BH-2，日本奥林巴斯公司；移液枪、培养皿、接种环、载玻片，江苏顺和教学仪器有限公司；低温冰箱，海尔集团；电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；手提式压力灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；隔水式恒温培养箱，上海博寻实业有限公司医疗设备厂；琼脂、葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、鼠李糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露醇、明胶、山梨醇、尿素、吲哚、枸橼酸盐、硫化氢、VP、MR，AR级，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要溶液和培养基

1）麦康凯琼脂配制。将17 g蛋白胨、3 g䏡胨、5 g胆盐和5 g氯化钠溶解于400 mL去离子水中，pH 7.2。将17 g琼脂加入600 mL去离子水中，使其加热并熔解。将2种液体混合，分装瓶内，并121℃高压灭菌15 min，冷却后备用。当需要使用时，需先加热熔化琼脂，加入10 g乳糖，冷却至50℃左右时，加入10 mL结晶紫水溶液和0.5%中性红水溶液5 mL，摇匀后倾注平板。

2）糖发酵管配制。用电子天平称取5 g牛肉膏、10 g蛋白胨、2g磷酸氢二钠、3 g氯化钠，将称取物与12 mL 0.2%滇麝香草酚蓝溶液置于1 000 mL的锥形瓶，定容，pH 7.4，按0.5%加入葡萄糖，分装至小试管内，121℃高压灭菌15 min。其他糖类发酵管均可按上述成分配好后分装每瓶100 mL，121℃高压灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 样本采集利用灭菌后的牙签和平皿收集新鲜粪便，取9只鸵鸟的粪便后分别用标签标记1～9。称重：称取1 g粪便；分装：浸入装有无菌水的试管；稀释：将试管底部利用振荡机振荡5 min；沉淀：将试管分别插入试管架，静置5 min；备用：用吸管取上清液分装到无菌试管。

1.2.2 细菌的分离培养在超净工作台上，将疑似有大肠杆菌的菌液划线接种于麦康凯培养基上，置于恒温培养箱内37℃培养24 h，挑取红色或粉红色的菌落继续在麦康凯培养基上传代培养，重复3～5次，得到纯培养后的大肠杆菌菌落，并观察其生长形态。

1.2.3 糖酵解试验制作葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、棉子糖等鉴定大肠杆菌所需的生化鉴定管，用接种针在酒精灯上灼烧后挑取纯化后的单个菌落接种，接种后用塞子封住管口，并放入恒温培养箱37℃培养24 h，观察并记录每根生化鉴定管发酵结果。

1.2.4 吲哚试验挑取麦康凯培养基上生长的单个菌落培养在邓亨氏蛋白胨水溶液中，置于恒温箱中37℃培养24～48 h，培养完成后于培养液中加入2～3 mL二甲苯溶液，摇匀后静置3 min，加入2 mL Ehrlich试剂，5 min后观察溶液颜色。

1.2.5 VP试验将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置于恒温箱中37℃培养48～72 h、培养液2.5 mL先加入5℃α萘酚（2-na-phthol）纯乙醇溶液0.6 mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.2 mL，摇动2～5 min，室温静置或36℃恒温箱10 min后观察溶液颜色。

1.2.6 MR试验将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置于恒温箱中37℃培养48 h，取出后加入甲基红试剂2～5滴，观察溶液颜色变化情况。

1.2.7 枸橼酸盐试验将被检菌接种并划线于枸橼酸钠琼脂斜面，置于恒温箱中37℃培养48 h，观察菌生长情况或培养基颜色。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与纯化

从表1可以看出，2、4、7、9号稀粪分离出菌株比3、5、6、8号干粪分离出的菌株生长颜色更鲜艳、菌落直径更大，且1号菌株与其他稀粪分离出的菌株颜色不同呈灰白色。2～9号菌株大肠杆菌在麦康凯培养基中培养24 h后，纯培养3次后生长肉眼可见为圆形、湿润、边缘整齐、红色的点状菌落，从1号干粪分离出的菌株接种在麦康凯培养基培养24 h，菌落颜色为白色、透明、湿润的圆形菌落，除颜色外形态特征均与典型大肠杆菌菌落相似，且3次纯培养生长后依旧为白色菌落（图1）。9株细菌革兰氏染色后均为阴性，均为大小不一、两端钝圆的短小杆菌（图2），9株菌株初步鉴定为大肠杆菌［14］。

表1 样品菌在麦康凯培养基前3次纯培养生长情况

图1 细菌在麦康凯培养基上的生长情况

图2 革兰染色镜检结果（1 000×）

2.2 生化鉴定

从表2可以看出，9株分离菌株均能发酵葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇、麦芽糖、鼠李糖，6株菌株能分解蔗糖、棉子糖，所有菌株均不能利用枸橼酸盐，所有菌株VP试验均为阴性，所有菌株MR试验和吲哚试验均为阳性。从表3可以看出，1号稀粪的菌株不能发酵乳糖，2、4、7、9号稀粪分离出的菌株发酵乳糖速度迟缓，3、5、6、8号干粪分离的菌发酵乳糖速度迅速［15，16］。大肠杆菌分解乳糖主要依赖于β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶透性酶。当两种酶同时存在，大肠杆菌才能分解乳糖，而出现迟发酵或不发酵乳糖的情况则可能是缺乏其中任何一种酶［17］，9株被检菌株均为大肠杆菌［18，19］。

表2 大肠杆菌生化鉴定结果

表3 大肠杆菌乳糖发酵情况

3 小结与讨论

鸵鸟作为目前世界上最大的走禽，其生长迅速、繁殖力强、抗病性强，具有较高的经济价值。目前，中国已有很多人工饲养的鸵鸟养殖场，但对鸵鸟的疾病与防治相关的研究并不全面。

大肠杆菌是引起禽类疾病的最常见的病原菌。作为肠道内常在菌，致病性大肠杆菌会对寄主造成损害，对寄主的存活、生长及发育产生重大影响。大肠杆菌为两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，可运动，无荚膜、无芽孢。大肠杆菌能够分解蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、葡萄糖等碳水化合物。大肠杆菌菌株能快速发酵乳糖，但也有少数菌株不发酵或延迟发酵乳糖［17］。

本试验以非洲鸵鸟粪便为研究对象，对分离、鉴定出的大肠杆菌进行培养，并与其他禽类大肠杆菌的形态特征对比。通过革兰氏染色以及显微镜下的形态学观察，为两端钝圆的革兰氏阴性杆菌，初步确定为大肠杆菌，而后通过生化鉴定，确定了所分离的菌株为大肠杆菌。本试验中从1号稀粪中分离的菌株对乳糖不发酵，因此在鉴定大肠杆菌时要考虑到不发酵或发酵迟缓的菌株存在的可能性，避免因考虑生化特性不全面而引起实验室诊断的误诊［20］，这种菌仍可能存在致病能力，应重视迟发酵或不发酵乳糖型大肠杆菌的研究。