HPLC法同时测定健脾补血片中党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的含量

★ 张小折 叶晓娅 薛晓会（平顶山市食品药品检验所 河南 平顶山 467000）

健脾补血片具有补血益气、健脾和胃、消积的作用，用于脾虚血少所致的面黄肌瘦、食少体倦等症。其质量标准仅制定了显微鉴别和理化鉴别［1］，未建立定量检测项。该制剂组方中药材成分繁多，仅以一个或两个指标性成分、单一波长进行质量控制不能全面科学地反映其内在产品质量，建立多指标成分控制模式已经成为中药质量研究的重要发展方向。健脾补血片由党参、茯苓、神曲茶、皂矾、炒黑豆、白术、陈皮和甘草组方而成，方中君药党参健脾益肺、养血生津；臣药茯苓健脾宁心、利水渗湿，神曲茶健胃消食；佐药包括健脾益气、燥湿利水的白术，养血补血的黑豆，燥湿化痰、止血补血、解毒敛疮的皂矾和理气健脾、燥湿化痰的陈皮；使药甘草调和诸药、补脾益气。为全面综合地评价健脾补血片的产品质量，本研究选取君药党参、臣药茯苓和神曲茶为研究对象，分析其所含的活性成分或代表性成分，采用HPLC双波长梯度洗脱法对健脾补血片方中党参中的党参炔苷和丁香苷、茯苓中的去氢土莫酸和茯苓酸4种成分含量进行同时测定，以期为全面综合评价健脾补血片内在产品质量和提升其质量标准提供科学的实验基础。

1 材料

Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；MS205DU型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；丁香苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111574-201605）；党参炔苷和去氢土莫酸对照品（成都普瑞法科技开发有限公司，批号：PRF8092221和PRF9042427）；茯苓酸对照品（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS010073）；健脾补血片（广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号：C2D001、D3E001、E2D001）；所用试剂均为色谱试剂，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解并制成每1 mL含1.252、0.116、0.322、0.378 mg的混合对照品贮备液；精密吸取混合对照品贮备液2.5 mL，至50 mL量瓶，用甲醇定容制成含党参炔苷0.062 6 mg/mL、丁香苷0.005 8 mg/mL、去氢土莫酸0.016 1 mg/mL和茯苓酸0.018 9 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取健脾补血片适量，除去包衣后研细，取约2.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声处理30 min，放冷后用甲醇定容至刻度，过滤得到健脾补血片供试品溶液。

2.3 阴性样品溶液的制备

健脾补血片由党参、茯苓、神曲茶、皂矾、炒黑豆、白术、陈皮和甘草组方而来，其中神曲茶由茯苓、麦芽、炒六神曲、炒山楂、广藿香、醋制香附、陈皮、炒苍术、紫苏叶、槟榔、桔梗、 姜制厚朴、白芷、 姜半夏、砂仁 、豆蔻和甘草加工而成，按质量标准WS3-B-2018-95中健脾补血片的工艺处方，分别制备不含党参、不含茯苓及不含神曲茶的阴性样品，按照“2.2”项下步骤制成阴性样品溶液。

2.4 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~12.0 min，15.0%A；12.0~18.0 min，15.0% → 46.0%A；18.0~39.0 min，46.0%→81.0%A；39.0~50.0 min，81.0%→15.0%A），流速为1.0 mL/min；检测波长：266 nm（0~18.0 min检测党参炔苷和丁香苷）［2-5］、210 nm（18.0~50.0 min检测去氢土莫酸和茯苓酸）［6-9］；进样量：10 µL。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性试验精密吸取“2.1~2.3”项下各溶液10 µL，依次注入高效液相色谱仪，依法检测，结果色谱图中主成分党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸与相邻色谱峰均能完全分离，且分离度均>1.5，阴性样品在健脾补血片中4个主成分相同保留时间处无色谱峰出现。见图1。

图1 各样品HPLC图

2.5.2 线性关系考察分别精密吸取“2.1”项下 混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，置20 mL量瓶中，用甲醇制成6个系列质量浓度的混合对照品溶液，各精密吸取10 µL，依法进样检测，以党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的峰面积为纵坐标（Y），主成分相应质量浓度为横坐标（X），进行线性回归计算。见表1。

表1 线性关系考察结果

2.5.3 进样精密度试验精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液10 µL，重复进样6次，得到党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸色谱峰峰面积的RSD分别为0.52%、1.16%、1.01%和0.95%。

2.5.4 重复性试验取健脾补血片样品（批号：C2D001）6份，按“2.2”项下步骤制备供试品溶液，依法进样测定并计算，得到党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸含量的RSD分别为1.20%、1.87%、1.79%和1.63%。

2.5.5 供试品溶液稳定性考察试验取健脾补血片同一份供试品溶液（批号：C2D001），于溶液制备后0、2、6、12、18、24 h进样检测，共测定6次，得到党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸峰面积的RSD分别为0.57%、1.29%、1.08%和0.87%，结果表明健脾补血片供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验取已知主成分含量的健脾补血片（批号：C2D001）9份，除去包衣后研细，每份约1.0 g，精密称定后随机分成3份，每份加入相同量的混合对照品溶液（党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的质量浓度分别为0.976、0.058、0.164和0.206 mg/mL），加入量分别为0.5 mL、1.0 mL和1.5 mL，按“2.2”项下步骤制备加样供试品溶液。在上述色谱条件下进行检测并计算党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的平均加样回收率及RSD。见表2。

表2 健脾补血片各成分加样回收试验结果（n=9）

2.6 含量测定

分别取健脾补血片样品3批，按照“2.2”项下步骤制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样检测，采用外标法计算党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的含量。见表3。

表3 样品含量测定结果（n=3） mg/片

3 讨论

3.1 供试品提取方法的选择

为保证健脾补血片中党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的综合提取率，本实验考察了提取方式（超声提取、加热回流提取）、提取溶剂（甲醇［2-8］、70% 甲醇［9］）及提取时间（20、30、40、60 min）对4个主成分提取率的影响，结果70%甲醇提取出较多的水溶性杂质，干扰检测。最终选择健脾补血片中党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的提取方法为甲醇超声提取30 min。

3.2 流动相的选择

因去氢土莫酸和茯苓酸在低波长210 nm附近吸收较为明显，本实验选择乙腈作为有机相，对乙腈 - 水［2-3,5］、乙腈 -0.1% 甲酸［4］、乙腈 -0.1% 磷酸［6］和乙腈-0.05%磷酸［7-9］四个流动相体系进行考察，结果发现采用乙腈-0.05%磷酸系统时，基线较为平稳，分离效果较好。为进一步完善检测效果，又对有机相和水相比例进行了摸索，最终确定按“2.4”项下方法测定健脾补血片中党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸。

3.3 色谱柱的选择

本实验对液相色谱柱Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Phenomenex Luna-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行了考察，发现Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）能满足健脾补血片中党参炔苷、丁香苷、去氢土莫酸和茯苓酸的检测，主成分色谱峰峰形对称性好，分离效果好，杂质数量适中，检测用时合适。

本文采用HPLC双波长梯度洗脱法建立了健脾补血片多指标成分质量控制模式，为健脾补血片质量标准提升和全面综合评价其产品质量提供参考依据。