神经节苷脂GM3联合姜黄素对血管平滑肌细胞行为的影响

★ 张清源 王龙 高萌 黄振东 吴千言 陈洪福 敖梅英（江西中医药大学 南昌 330004）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致冠心病和中风等心血管疾病的主要病理基础，是危害人们身体健康的罪魁祸首之一，是许多重要常见疾病或死亡的根源［1］。血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要成分之一，其异常增殖、迁移、泡沫化、胶原蛋白分泌等生理行为是动脉粥样硬化发展过程的关键影响因素［2］。

姜黄素的母体之一有姜黄，是破血行气，通经止痛的常用中药。现代研究发现姜黄素可以抑制炎症反应、抗氧化、抗类风湿、抗动脉粥样硬化等作用［3］，临床上已将其用于防治老年痴呆等疾病，但是如何提升其防治动脉粥样硬化的效用有待进一步探索。神经节苷脂GM3是含单个唾液酸的神经节苷脂，在动脉粥样硬化斑块中GM3含量为正常血管内壁的多倍［4］，已有研究于2019年证实血液GM3微环境可多环节延缓动脉粥样的形成与发展［5］。那么GM3微环境是否对姜黄素调整血管平滑肌细胞行为具有协同作用呢？本文将探讨GM3、姜黄素两者单用与联合使用（即GM3微环境下使用姜黄素）对血管平滑肌细胞行为的影响，以期从血管平滑肌细胞角度为GM3与姜黄素预防或治疗动脉粥样硬化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞与培养基大鼠胸主动脉平滑肌细胞（RASMCs）购自湖南省长沙市湘雅医学院细胞中心。高糖培养基（DMEM）购自美国Gibco生物试剂公司，胎牛血清购自美国Hyclone生物试剂公司，胰蛋白酶、青霉素与链霉素购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.1.2 药物试剂及其配置神经节苷脂GM3粉末购自瑞士Adipogen生命科学试剂公司，以磷酸缓冲溶液（PBS）为配置液。姜黄素粉末购自北京索莱宝生物科技有限公司，以细胞培养基为配置液。氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL)购自广州奕源生物科技有限公司，用PBS稀释至实验浓度。羟脯氨酸（Hyp）测定试剂盒（A030-1-1）购自南京建成生物试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组RASMCs以含8%胎牛血清与1%青霉素与链霉素的DMEM为培养基，在37 ℃，5% CO2的生化培养箱中培养。显微镜下观察生长情况，细胞铺满基底时，用胰酶消化并传代。进行各项指标检测实验时，将细胞分为对照组（常规培养基）、模型组（常规培养基添加诱导剂）、GM3给药组（诱导剂+10 μg/mL或50 μg/mL GM3）、姜黄素给药组（诱导剂+10 μM或20 μM姜黄素）、联合用药实验组（诱导剂+10 μg/mL GM3+10 μM 姜黄素）。

1.2.3 细胞活性检测RASMCs以约5 000细胞/孔的密度种于96孔板，细胞大致铺满孔板基底后，添加不同浓度GM3与姜黄素，分别作用于细胞18 h。之后采用MTT试验法，弃培养基，PBS清洗细胞2遍，吸干，加培养基100 μL，加5 mg/mL的MTT 20 μL，混匀，37 ℃，5%CO2的细胞培养箱孵育4 h。之后弃液体，加100 μL DMSO，37 ℃避光轻轻震荡10 min，使晶体完全溶解。酶标仪提前预热30 min，570 nm 测定吸光值［6］。

1.2.3 细胞增殖检测同上述操作种孔，待细胞贴壁3h左右，血清饥饿处理8 h［6］。PBS清洗后，模型组与实验组以10%FBS为刺激剂诱导细胞异常增殖，实验组同时给予预设浓度药物，分别继续培养48 h。后续操作同上述MTT步骤。

1.2.4 划痕试验法［7］将对数生长期的RASMCs种于24孔板，给予上述MTT法相同的血清饥饿处理，待铺满基底的75%左右时，用100 μL枪头在孔板中央划一条宽度均匀的线，之后用PBS缓冲溶液洗去划线所致的漂浮细胞，即刻无菌显微成像，记作0 h。之后以10%FBS为刺激剂诱导细胞异常增殖迁移，培养箱继续培养24 h，再次成像，记作24 h。将前后成像的划痕图片，通过Image J软件进行细胞迁移定量分析。

1.2.5 油红染色法以80 μg/mL的ox-LDL刺激模型组与实验组细胞24 h，诱导RASMCs脂质沉淀与泡沫化。增加诱导剂的同时，实验组增加不同浓度药物干预细胞泡沫化过程。干预结束后以PBS清洗细胞，用4%多聚甲醛于室温固定细胞20 min，PBS清洗，60%异丙醇预处理细胞2 min；之后用新配置的0.5%油红O避光染色30 min,然后用60%异丙醇室温避光脱色5~10 min 2次；PBS再次清洗2次，显微镜成像［8］。平均脂质沉淀面积与总细胞面积的比例情况，以Image J软件进行定量分析。

1.2.6 消化检测法［9］羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在，故采用消化法检测羟脯氨酸水平，以反应细胞胶原蛋白分泌水平。以80 μg/mL的ox-LDL刺激细胞异常分泌胶原蛋白，诱导的同时，实验组增加药物干预，作用36 h候，取细胞培养液进行羟脯氨酸水平检测，步骤参照试剂盒说明书。

1.3 统计学方法

实验数据采用Prism Graphpad 5软件进行统计学分析，各组数据均进行正态检验及方差齐性检验，采取方差分析。

2 研究结果

2.1 药物对细胞活性的影响

为摸索药物的适宜实验浓度，设置多个浓度进行药物毒性实验，采用MTT法检测剩余活细胞数目情况，以揭示不同浓度药物对细胞活性的影响。结果显示:当外源GM3浓度高达100 μg/mL时，吸光值略有下降，但无显著性差异；10、20 μM的姜黄素浓度对细胞活性无影响；当姜黄素浓度高至40、80 μM 时，RASMCs活性受到抑制，与 0 μg/mL药物浓度组相比，呈现显著性差异。为避免药物对细胞活性的影响，本研究GM3药物浓度设置为10、50 μg/mL，姜黄素药物浓度设置为 10、20 μM。见图1。

图1 不同药物浓度对RASMCs细胞活性的影响

2.2 药物对细胞增殖的影响

药物对细胞异常增殖的影响，实验显示：10 μg/mL外源GM3对RASMCs增殖无明显抑制作用；50 μg/mL外源GM3可抑制RASMCs增殖，与Model组相比呈显著性；10 μM姜黄素对RASMCs增殖无明显影响；20 μM姜黄素对RASMCs增殖呈抑制效果，与Model组相比呈显著性；然而，当GM3与姜黄素协同作用于RASMCs时，即使浓度分别低至10 μg/mL与10 μM，对RASMCs增殖亦呈现抑制效果，与Model相比呈极显著性，呈现协同增效的抑制作用。见图2。

图2 不同药物浓度对RASMCs细胞增殖的影响

2.3 药物对细胞异常迁移的影响

细胞划痕试验显示，10 μg/mL外源GM3对RASMCs异常迁移无明显抑制作用；50 μg/mL外源GM3对RASMCs异常迁移呈现抑制作用，与Model组相比呈显著性；10 μM 或 20 μM 姜黄素对RASMCs异常迁移无明显影响；当GM3与姜黄素协同作用于RASMCs时，即使浓度分别低至10 μg/mL与10 μM，对RASMCs异常迁移呈现抑制效果，与Model相比呈极显著性，呈现协同增效的抑制作用。见图3。

图3 划痕法检测药物对RASMCs异常迁移的影响

2.4 药物对细胞泡沫化的影响

油红O着色脂质沉淀试验显示，10 μg/mL外源GM3对RASMCs脂质沉淀有抑制趋势，但无显著性差异；10 μM姜黄素对RASMCs脂质沉淀亦无明显影响；当两者以相同浓度协同作用于RASMCs时，RASMCs脂质沉淀被抑制，呈现协同增效抑制作用，与Model组相比差异呈极显著性。见图4。

图4 油红O染色检测药物对RASMCs泡沫化的影响

2.5 药物对细胞分泌胶原蛋白的影响

羟脯氨酸检测实验显示，当外源GM3与姜黄素单用，浓度分别为 10 μg/mL、10 μM 时，对RASMCs胶原蛋白分泌量无明显影响；当两者联合作用于RASMCs时，细胞胶原蛋白分泌被抑制，呈现协同增效抑制作用。见图5。

图5 不同药物对RASMCs胶原蛋白分泌量的影响

3 讨论

血管壁由内膜、中膜、外膜三层组成。血管平滑肌细胞是构成血管壁中层的主要细胞成份,是血管执行生理功能的结构基础，对血管壁的完整性和调节血管的紧张性起着重要作用，其增殖、迁移、泡沫化、胶原合成等生理行为异常是动脉粥样硬化发展的关键步骤［10-12］，研究药物对血管平滑肌细胞细胞的生理和病理行为的影响，对于深入了解药物防治动脉粥样硬化具有重要意义。

已有研究通过apoE-/-C57小鼠实验证明外源性GM3显著降低血脂水平和动脉粥样硬化斑块面积的作用，揭示了富含GM3的微环境在动脉粥样硬化形成中起保护作用［5］。姜黄素是一种从姜科植物姜黄等的根茎中提取得到的黄色色素，为酸性多酚类物质，主链为不饱和脂族及芳香族基团，不溶于水。神经节苷脂GM3为带唾液酸脂类小分子物质，在动脉粥样硬化斑块表面富含。外源添加GM3为血管RASMCs提供了富含GM3分子的微环境，该微环境抑或促进姜黄素物质的流转，从而帮助调整血管平滑肌细胞异常生理行为。