冀东野生大豆对草甘膦的耐性鉴定及耐性机制初步研究

王 宇 张 锴 王艳丽 司增志 王冰冰 乔亚科,*

(1 河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛 066000； 2 河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北 秦皇岛 066000)

草甘膦(N-膦酰甲基甘氨酸)是目前大豆生产上广泛使用的除草剂。草甘膦在植株体内作用靶标为5-稀醇式丙酮-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，通过竞争磷酸稀醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，抑制植株体内EPSPS酶活性，导致植株体内莽草酸大量积累，抑制芳香族氨基酸(即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的生物合成，最终导致植株死亡[1]。由于栽培大豆(Glycinemax)草甘膦耐性较差，大豆生产迫切需求耐草甘膦新品种。野生大豆(Glycinesoja)是栽培大豆的近缘野生种，仅天然存在于中国、日本、韩国等少数国家，是栽培大豆宝贵的种质资源。野生大豆存在耐干旱[2]、耐盐碱[3-5]的优异种质资源，且与栽培大豆无生殖隔离，是栽培大豆优异耐性基因的来源。

在耐草甘膦野生大豆种质筛选方面，高越等[6]对67份野生大豆的耐草甘膦进行鉴定，发现不同野生大豆材料间的草甘膦耐性差异很大，通过田间喷施鉴定筛选到高耐草甘膦野生大豆材料ZYD0685和ZYD2405。王迪[7]对425份野生大豆进行耐草甘膦鉴定，筛选到2011-32等26份抗性较好的野生大豆种质。说明野生大豆中存在草甘膦耐性优异的种质资源，可作为亲本材料与栽培大豆配制杂交组合，创制耐草甘膦栽培大豆新品种。

草甘膦处理能够显著影响栽培大豆生理生化过程。Reddy等[8]研究发现，1.12 kg a.i·hm-2浓度的草甘膦喷施可显著降低敏感大豆材料的叶绿素含量，但对耐性大豆材料的叶绿素含量无显著影响，Krenchinski等[9]和Zobiole等[10-11]也报道了类似结果。原向阳等[12]研究了缺磷胁迫条件下喷施草甘膦对抗草甘膦大豆材料的影响，发现缺磷胁迫和喷施草甘膦显著降低了抗草甘膦大豆的光合速率，说明喷施草甘膦对植株的光合作用影响较大。此外，草甘膦喷施与大豆地上部和根系生物量以及根瘤生物量和数量的减少有关[13-15]。同时有研究发现，草甘膦处理除影响植株光合作用外，还会引发植株体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量升高和抗氧化防御系统失活，进一步引发脂质过氧化，这可能是引发植株细胞死亡的原因[16-17]。

种植耐草甘膦大豆品种并喷施草甘膦是解决大豆种植中杂草问题的关键。目前，耐草甘膦作物主要通过两种策略获得：过表达或沉默植株EPSPS基因[18-19]，但该方法可能导致草甘膦在植物组织中积累，对作物产量造成影响[20]；过表达草甘膦氧化还原酶(glyphosate oxidoreductase，GOX)基因或草甘膦N-乙酰转移酶(glyphosate N-acetyltransferase，GAT)基因。GOX基因能够降解草甘膦为乙醛酸和氨基甲基膦酸，使草甘膦对作物的毒害降低，而GAT通过催化草甘膦的乙酰化作用，降解草甘膦残基[21-22]。在大豆耐草甘膦品种培育方面，目前应用较多的是过表达CP4-EPSPS基因，该基因来源于土壤细菌Agrobacteriumsp.菌株CP4，由于其与草甘膦的亲和力较低，过表达该基因的转基因植物具有正常EPSPS基因功能，表现出对草甘膦较强的耐受性[23]。除此之外，也有其他抗草甘膦基因应用于大豆育种的研究[24-25]，但是由于这些大豆品种均需通过转基因技术获得，目前无法在我国种植，因此筛选耐草甘膦野生大豆种质并将其耐性基因通过杂交手段转入栽培大豆中是解决我国大豆生产上面临难题的有效途径。

本试验对采集于河北省的862份野生大豆材料进行耐草甘膦鉴定，对筛选的高耐和高敏野生大豆材料喷施草甘膦后的莽草酸含量、脂质过氧化水平(MDA含量)、叶绿素含量、抗氧化酶活性及EPSPS基因表达等与草甘膦耐受性相关的指标进行测定，旨在筛选高耐除草剂野生大豆种质并初步解析其耐性机制。

1 材料与方法

1.1 试材种植及草甘膦耐性鉴定

862份野生大豆材料由河北科技师范学院野生大豆课题组提供。由于野生大豆种子外覆盖一层泥浆膜，在播种前需要用小刀破皮。把破皮的野生大豆种子种植于50孔育苗盘内，每个材料播3孔，每孔播5粒种子。育苗盘置温室中培育发芽，至V2生长阶段，即第二对复叶完全展开时，喷施浓度为1.125 kg a.i·hm-2、 有效成分含量为41%草甘膦异丙胺盐水剂(孟山都，美国)处理液。用手持喷雾器对植株叶片进行均匀喷雾。7 d后观察记录植株受害症状，按表1标准划分耐性等级：

表1 野生大豆耐草甘膦鉴定耐性等级分级标准Table 1 Classification standard for glyphosate tolerance grade of wild soybean

1.2 生理指标测定

将筛选到的高耐和高敏野生大豆材料在营养钵中种植。V2期喷施浓度为1.125 kg a.i·hm-2的草甘膦溶液，以喷施清水为对照，0、3、10、24、48 h后取样测定。丙二醛(malondialdehyde, MDA)和叶绿素含量测定参照王鹏等[26]的方法，莽草酸含量测定参照原向阳等[27]的方法，过氧化物酶(peroxidase，POD)活性利用A084-3-1过氧化物酶测定试剂盒进行测定(南京建成生物工程研究所)，过氧化氢酶(catalase，CAT)活性利用A007-1-1过氧化氢酶测定试剂盒进行测定(南京建成生物工程研究所)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性利用A001-3-2总超氧化物歧化酶测定试剂盒进行测定(南京建成生物工程研究所)。上述试验均设3次生物学重复。

1.3 草甘膦相关基因表达测定

高耐和高敏野生大豆材料种植及取样方法同1.2。取野生大豆材料植株叶片提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，β-Tubulin为内参基因进行草甘膦耐性相关基因EPSPS表达量的测定。通过GenBank获得基因全长并利用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物，其中EPSPS基因qRT-PCR检测所用引物为F：TGCTTTCTTGGCACAAACTG/R：AATTTCCACATCGCCAAGAG，β-Tubulin基因所用引物为F：GGAGTTCACAGAGGCAGAG/R：CACTTACGCATCACATAGCA。qRT-PCR利用OneStepSYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit [Code No.RR066A，宝生物工程(大连)有限公司)]试剂盒在Bio-Rad CFX96 荧光定量PCR仪(伯乐，美国)上进行测定。采用2-ΔΔCt法对实验数据进行分析。

1.4 数据处理

应用 SAS 9.2统计软件进行各处理差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 野生大豆耐草甘膦鉴定及高耐材料筛选

草甘膦喷施处理野生大豆7 d后，264份野生大豆材料全部死亡(基本株数为30株，下同)，药害等级为5级，占30.64%；450份材料存活株数在5株以内，药害等级为4级，占52.20%；82份材料存活6～14株，药害等级为3级，占9.51%；42份材料存活15～24株，药害等级为2级，占4.87%；24份材料存活25～29株，药害等级为1级，占2.78%。其中药害等级为1、2级的野生大豆材料见表2。材料Yong-33在喷施1.125 kg a.i·hm-2草甘膦7 d后，植株存活率达96.67%。

表2 草甘膦处理后药害等级为1、2级的野生大豆材料Table 2 The wild soybean materials of phytotoxicity grade 1 and 2 with glyphosate treatment

2.2 草甘膦处理对野生大豆MDA及莽草酸含量的影响

草甘膦处理后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33 的MDA和草甘膦含量与对照(喷施清水)相比，在0、3、10、24、48 h均无显著差异。敏感材料2010-1的MDA和草甘膦含量在0、3、10、24、48 h与对照相比均显著升高(图1)。

注：柱上不同字母表示同一检测时间点内差异显著(P<0.05)。下同。Note：The different letters indicates significant difference at the same time point at 0.05 level. The same as following.图1 草甘膦处理对野生大豆MDA和莽草酸含量的影响Fig.1 Effects of glyphosate treatment on the contents of MDA and shikimic acid in wild soybean

图2 草甘膦处理对野生大豆POD、CAT、SOD活性及叶绿素含量的影响Fig.2 Effects of glyphosate treatment on POD, CAT and SOD activities and chlorophyll content in wild soybean

2.3 草甘膦处理对野生大豆抗氧化酶系活性及叶绿素含量的影响

草甘膦处理后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33 的POD、CAT和SOD活性在检测的各时间点与对照相比均显著升高。敏感材料2010-1的POD、CAT和SOD活性在检测的各时间点与对照相比均无显著差异(图2-A、B、C)。

喷施草甘膦后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33 的叶绿素含量在检测的各时间点与对照相比均无显著差异。敏感材料2010-1的叶绿素含量在检测的各时间点与对照相比均显著降低(图2-D)。

2.4 草甘膦处理对野生大豆EPSPS基因表达量的影响

由图3可知，草甘膦处理后，高耐草甘膦野生大豆材料Yong-33的EPSPS基因表达量在检测的各时间点与对照相比均显著升高。敏感材料2010-1的EPSPS基因表达量在检测的各时间点与对照相比均无显著差异。

图3 草甘膦处理对野生大豆EPSPS基因表达量的影响Fig.3 Effects of glyphosate treatment on EPSPS gene expression in wild soybean

3 讨论

本研究对862份野生大豆材料进行耐草甘膦鉴定，结果发现，82.83%的野生大豆材料在喷施1.125 kg a.i·hm-2草甘膦后药害等级达4级以上；王迪[7]研究了425份野生大豆的草甘膦耐性水平，发现93.88%的野生大豆材料在草甘膦处理后药害等级达4级以上；高越等[6]研究了67份野生大豆的草甘膦耐性水平，发现92.39%的野生大豆材料在草甘膦处理后药害等级达4级以上；商璐[28]对100份栽培大豆进行草甘膦耐性筛选，发现95.00%的栽培大豆材料在草甘膦处理后药害等级达4级以上。以上结果说明，野生大豆与栽培大豆的草甘膦耐性均较差。但本研究筛选到Yong-33等高耐草甘膦的野生大豆材料，说明野生大豆中存在高耐草甘膦的种质。所施草甘膦浓度不同可能是造成野生大豆耐性差异的因素，在今后的野生大豆耐草甘膦鉴定中，应选择相同浓度的草甘膦进行处理，以便比较不同研究结果。

常丽娟等[29]研究发现，干旱和草甘膦双重胁迫下耐草甘膦大豆(转基因大豆品种GTS 40-3-2)植株内POD和SOD活性均比对照显著升高，且随草甘膦浓度升高而升高。原向阳等[30]研究发现，草甘膦处理引发高敏大豆植株保护酶系的活性降低，活性氧代谢失衡，导致质膜过氧化。本研究发现，草甘膦处理高耐野生大豆材料Yong-33后，植株体内活性氧清除酶系POD、CAT和SOD活性均迅速升高，这些酶活性的升高可清除细胞内由于草甘膦处理引发的高水平ROS，该过程对保持细胞活性氧平衡至关重要。结合耐草甘膦野生大豆材料在草甘膦处理后MDA及叶绿素含量与对照相比无显著差异的结果，说明其细胞内未发生脂质过氧化，叶片功能正常。在草甘膦处理后，高敏野生大豆材料POD、CAT和SOD活性与对照相比均无显著差异，结合其体内MDA含量与对照相比显著升高。说明在草甘膦处理后高敏野生大豆材料的ROS含量可能升高，导致脂质过氧化，这可能是导致野生大豆细胞死亡，最终表现叶片黄化、严重萎蔫的原因。

草甘膦在植物体内的靶标为EPSPS，草甘膦处理植株后，抑制植株EPSPS活性，导致莽草酸在植株体内的积累[1]。王迪[7]和商璐[28]的研究结果均表明，草甘膦处理的耐草甘膦大豆品种植株中，莽草酸含量升高水平显著低于敏感大豆材料。贾惠舒等[31]研究表明，与对照相比，在草甘膦处理的转GmEPSPS1基因的大豆植株中莽草酸含量显著降低，并且在浓度为0.5‰和1.0‰草甘膦处理下表现出较低的叶片损伤程度和较好的生长状态。本研究发现，在草甘膦处理后，与对照相比，高耐材料莽草酸含量无显著差异，高敏材料莽草酸含量显著升高。说明野生大豆在草甘膦处理后莽草酸含量有升高的趋势，且升高速率和含量水平可能与植株对草甘膦的耐性强弱有关。

目前，生产上应用的耐草甘膦大豆品种多是利用转基因技术过表达外源EPSPS基因获得[23-25,32]，表明EPSPS基因在栽培大豆耐草甘膦胁迫中发挥重要作用。Gao等[33]研究了野生大豆中EPSPS基因的表达量，发现在草甘膦处理后，耐性材料中EPSPS1 mRNA水平增加2～4倍。本研究发现，高耐草甘膦野生大豆植株在草甘膦处理后EPSPS基因表达显著上调，可能导致EPSPS酶含量水平升高，补偿了草甘膦抑制的EPSPS酶活性，从而提高对草甘膦的耐受性。在草甘膦处理后，高耐野生大豆材料体内莽草酸含量与对照相比无显著差异，进一步印证了上述推论。而敏感材料经草甘膦处理后EPSPS基因表达与对照无显著差异，草甘膦限制了EPSPS酶活性，导致其体内莽草酸含量与对照相比显著升高。

4 结论

本研究通过对862份野生大豆进行耐草甘膦鉴定，发现大部分野生大豆草甘膦耐性较差，但存在高耐草甘膦种质资源。高耐野生大豆材料在草甘膦处理后植株体内活性氧清除酶系活性显著升高，EPSPS基因表达显著上调。敏感材料草甘膦处理后细胞内活性氧水平升高。草甘膦处理除影响植株EPSPS酶活性外，对植株活性氧水平也有较大影响。