乙醛脱氢酶1B1、LRFN4在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征及预后的关系

陈林涛 姚毅明 周学伟 王红雷

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种消化道系统的恶性肿瘤，近年来，结直肠癌在我国的发病率和死亡率均呈上升趋势，且生存率偏低，5年生存率仍低于40%[1-2]，这主要是饮食结构发生改变、癌症的早期筛查不足所导致的[3]。因此，筛选有效且灵敏的结直肠癌生物标志物对其预防、早期诊断和预后改善具有重要意义。LRFN4属于LRFN家族蛋白，是一种神经元特异性蛋白，研究报道，LRFN4可在多种肿瘤中表达[4]。乙醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)在胃癌、神经胶质瘤等多种肿瘤中异常表达，且与预后有关。ALDH1B1与ALDH1A1具有同源性，且ALDH1B1在正常小肠、肝脏和胰腺组织中呈高水平表达[5-6]。但LRFN4、ALDH1B1表达在结直肠癌中的研究较少，因此本研究分析LRFN4、ALDH1B1与结直肠癌患者的临床病理特征及预后的关系，探讨LRFN4、ALDH1B1与结直肠癌发生发展及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年1月本院收治的结直肠癌患者90例，年龄18～69岁，平均(57.32 ±7.64)岁。纳入标准：①符合《中国结直肠癌诊疗规范(2020年版)》[7]中关于结直肠癌的诊断标准，患者经病理检查确诊为结直肠癌； ② 接受规范性的结直肠癌根治手术，且术前未进行任何抗肿瘤治疗；③患者签署自愿受试同意书及知情同意书。排除标准：①临床病历信息和随访资料不完整；②合并其他恶性肿瘤患者；③术前已转移、接受姑息性切除的患者。

1.2 ALDH1B1、LRFN4检测

收集结直肠癌组织，采用Quick-Ray手动组织芯片仪(美国UNITMA公司)取直径2.0 mm的组织制成组织微阵列(TMA)芯片蜡块，经脱蜡水化与抗原修复后，分别滴加兔抗人LRFN4抗体以及ALDH1B1抗体(赛默飞世尔科技有限公司)，PBS冲洗后滴加二抗(赛默飞世尔科技有限公司)。免疫组化结果：在高倍镜下观察，细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，阳性细胞染色强度分值：0分(阴性)、1分(弱阳性)、2分(中等阳性)、3分(强阳性)。阳性细胞所占百分比0～1%为0分，>1%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。染色强度和阳性细胞的百分比两者相乘获得0～12分的总染色得分，其中0～4分定义为低表达或无表达，5～12分定义为高表达。

1.3 临床资料收集及随访

通过查阅患者病历档案，收集患者临床资料，包括性别、年龄、肿瘤组织学分级、TNM分期等。采用电话或门诊复诊等随访方式，截止时间为2021年2月。记录患者的总生存期(overall survival，OS)：确诊之日至患者死亡或最后1次随访日期。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 结直肠癌患者组织ALDH1B1、LRFN4的表达与临床病理特征关系

在结直肠癌组织中LRFN4表达与淋巴结转移、TNM分期显著相关(P<0.05)，与年龄、性别、组织学分级等病理特征无关(P>0.05)；在结直肠癌组织中ALDH1B1表达与TNM分期显著相关(P<0.05)，与其他病理特征无关(P>0.05)，见表1。

表1 结直肠癌患者组织ALDH1B1、LRFN4的表达与临床病理特征关系/例

2.2 ALDH1B1、LRFN4表达与结直肠癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析显示：LRFN4高表达患者的总生存率显著高于低表达组，差异有统计学意义(P=0.027)；ALDH1B1高表达患者的总生存率显著低于低表达组，差异有统计学意义(P=0.025)。见图1。

图1 结直肠癌患者 Kaplan-Meier生存曲线

2.3 影响结直肠癌患者预后的单因素和多因素分析

单因素分析发现ALDH1B1表达、LRFN4表达和TNM分期与结直肠癌的不良预后有关，将上述单因素引入多因素Cox回归模型分析发现ALDH1B1表达、LRFN4表达和TNM分期是结直肠癌患者预后的独立影响指标，见表2。

表2 ALDH1B1、LRFN4与预后的单因素和多因素分析

3 讨论

结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，是全球第三大常见恶性肿瘤，虽然目前在对其的治疗取得了很大的进步，但是治疗后的结直肠癌患者依然存在转移和复发的风险[8-9]。因此结直肠癌在治疗和预后监测上面临巨大挑战，寻找能预测结直肠癌患者预后的生物标志物是目前临床上关注的重点。 ALDHs是一组催化醛类氧化为羧酸的依赖性酶，已被研究证实可作为多种癌症的生物标志物[10]，其中ALDH1是ALDHs超家族成员之一，ALDH1的亚型包括ALDH1B1和ALDH1A1[11]。研究报道ALDH1B1在肺、乳腺、卵巢的腺癌组织中均有表达，另外有研究显示ALDH1B1在结直肠癌组织中的表达高于癌旁组织，且高于ALDH1A1阳性表达率[12-13]。本研究结果显示结直肠癌组织中ALDH1B1表达与TNM分期显著相关，ALDH1B1高表达患者的总生存率显著低于低表达组，且ALDH1B1表达是结直肠癌患者预后的独立指标。这提示ALDH1B1表达与结直肠癌的预后有关，ALDH1B1表达与患者的总生存期呈负相关，说明ALDH1B1在结直肠癌的表达越高，其患者预后越差。 LRFN又称突触黏附样分子，共有5名家族成员，其结构域相似，但是各自的功能不同，以前的研究仅限于LRFN家族成员在神经组织的表达和功能上的探讨，研究发现下调LRFN1的表达会导致胰腺癌细胞的存活率发生下降，在某些包括Panc-1、MKN7等癌细胞系中也会发现LRFN4的表达[14-15]。肿瘤细胞可以募集包括间充质细胞、内皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞在内的基质细胞，促进肿瘤生长并向远处转移[16-17]。其中免疫细胞可通过诱导和维持肿瘤血管生成，刺激肿瘤细胞增殖、组织浸润，向远处转移[18-19]。根据研究报道在具有巨噬细胞分化的单核细胞中LRFN4的表达被上调，在诱导单核细胞/巨噬细胞向炎症区域的迁移中起到了关键性作用，因此可以推测LRFN4有参与结直肠癌的传播、复发等过程，诱导巨噬细胞免疫、肿瘤细胞生长受限制[20-21]。本研究结果显示结直肠癌组织中LRFN4表达与淋巴结转移、TNM分期显著相关，LRFN4高表达患者的总生存率显著高于低表达组，显著降低了结直肠癌患者的死亡风险，是结直肠癌患者独立预后的指标。这提示结直肠癌组织中LRFN4高表达可能起着抑制肿瘤进展的作用，可能成为评估患者预后的生物学指标。

综上所述，结直肠癌组织中ALDH1B1、LRFN4的表达与临床病理特征及预后密切相关，有成为预测结直肠癌患者预后生物标志物的潜力，亦有望成为肿瘤生物治疗的新靶点。然而，本研究存在一定的不足，首先本研究仅限于临床样本分析，未在细胞及动物层次上进一步分析ALDH1B1和LRFN4表达对结直肠癌的作用机制；其次本研究为单一中心，收集样本为90例，存在样本量不足的问题，结果可能产生偏移，需要未来制定更具前瞻性的试验研究来验证。