GKN2、CCL17表达与胃癌病理分期及预后的关系

王晓娟 董 娜 刘世琼

胃癌是胃最常见的恶性肿瘤，其发病原因主要是与幽门螺杆菌感染以及长期的胃部慢性良性疾病等有关[1]。胃癌早期可毫无症状，少数出现上腹部饱胀不适、隐痛、反酸、嗳气等非特异性的上消化道症状，胃窦癌常出现类似十二指肠溃疡的症状，按慢性胃炎和十二指肠溃疡常规治疗，症状可暂时缓解，易被忽视[2]。若不能及时得到有效治疗，可能会发展为较严重的晚期胃癌。临床可根据较宏观的淋巴结转移情况、肿瘤直径、肿瘤浸润程度判断胃癌病理分期[3]。胃癌主要是通过手术及放化疗进行治疗，且治疗后患者需要较长一段时间的康复期，所以临床一般讲究“早发现、早治疗、早康复”[4]。患者治疗后有效的预后指标不仅能够较直观具体的体现患者恢复情况，也能够评估患者治疗方式或治疗药物的临床疗效[5]。但是临床诊断及相关预后指标一般都是一些较宏观的指标。当胃癌相关的生物学指标发生细微变化，且并未出现宏观表现时，较难被诊断出来，当胃癌相关的生物学指标由量变发生质变，出现宏观表现时，治疗难度亦增加，预后也会受到影响。胃动蛋白2(Gastrokine 2，GKN2)、趋化因子17(C-C Motif Chemokine Ligand 17，CCL17)均是胃癌相关微观生物学指标[6]。本研究将通过分析GKN2、CCL17表达水平，探讨其与胃癌病理分期及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年10月～2019年8月在我院收治的152例胃癌患者作为观察组，其中男性108例，女性44例；年龄30～75岁，平均年龄(50.35±3.74)岁；其中早期患者32例，进展期患者83例，晚期患者37例。纳入标准：①符合《胃癌治疗指南》中对胃癌病理分期的相关标准[7]；②所选患者均知情并签署知情同意书。排除标准：①依从性差，无法配合完成本研究；②病历资料不详细；③合并恶性肿瘤、精神系统疾病、心脑血管疾病病史者。另选取同一时期于我院行体检查健康的70例患者作为对照组，其中男性38例，女性32例；年龄31～75岁，平均年龄(51.13±3.24)岁。

1.2 研究方法

CCL17表达水平测定：采用过氧化物酶免疫组织化学技术进行测定。将152例胃癌患者及50例体检健康患者组织标本采用石蜡常规切片，切成4～5 μm左右切片标本后，置于涂好多聚赖氨酸的玻片上。于68℃烤片机进行烘烤，持续4 h左右。于二甲苯及酒精中进行组织脱蜡，随后用蒸馏水连续冲洗3次，每次持续3分钟左右，于pH值为7.4酸碱度下进行PBS冲洗3次，每次持续5 min[8]。在所选切片上需滴加3%H2O2溶液1滴进行孵育，持续15 min左右，结束后重复进行上述冲洗步骤。冲洗后于切片滴加CCL17多克隆抗体(Abnova中国区域总代理艾美捷科技有限公司，货号：H00006361-A01)1滴，继续孵育30 min，PBS冲洗10 min左右[9]。所选切片于室温下逐个滴加DAB显色液，实用实验室显微镜查看显色结果后进行自来水冲洗。所选切片逐个滴加苏木精进行复染1 min左右，自来水冲洗后返蓝10 min左右[10]。最后逐步进行梯度酒精脱水及二甲苯透明操作，采用中性树胶封片，于显微镜下观察染色结果。GKN2表达水平测定：同上述操作步骤，将上述操作步骤中CCL17多克隆抗体更换为GKN2抗体(上海博耀生物科技有限公司，货号：E-EL-H2054)。

1.3 结果判定

先于低倍镜下观察切片，选取染色较均匀区域，再于高倍镜下选取5个不重叠视野范围，对每个视野范围进行细胞计数，规定每个范围内有200个肿瘤细胞方便后续统计及比较。根据每个区域内阳性细胞率及着色强度对5个区域进行评分[11]。阴性：仅细胞核核膜上着色为黄色或未着色；阳性：细胞浆及细胞核核膜上呈现明显淡黄色、黄色或橙色。着色强度：着色结果为阴性、淡黄色、黄色或橙色，分别计分0、1、2、3分。阳性细胞率：每个视野范围内结果为阳性细胞总数占200个细胞数百分比。<10%计0分，10%～25%计1分，25%～50%计2分，>50%计3分。每个区域内阳性细胞率及着色强度相加之和为蛋白表达水平。0分：不表达，1～2分：低表达，3～4分：中表达，5～6分：高表达。

1.4 统计学方法

本数据的统计分析应用SPSS 22.0软件进行，计数资料以例数(n)及百分率(%)表示，采用χ2检验，多因素分析两组患者GKN2、CCL17表达水平与临床病理指标关系及1年内生存率及复发率的相关性。检验标准=0.05，当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组GKN2、CCL17阳性表达率比较

观察组GKN2阳性表达率显著低于对照组(P<0.05)；观察组CCL17阳性表达率显著高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组GKN2、CCL17阳性表达比较(例，%)

2.2 GKN2、CCL17表达水平与胃癌病理分期和预后的关系

GKN2、CCL17表达水平与肿瘤组织分化程度无显著相关性(P>0.05)，与病理分期及预后显著相关(P<0.05)，见表2。

表2 GKN2、CCL17表达水平与胃癌病理分期和预后的关系/例

2.3 多因素分析GKN2、CCL17表达水平与胃癌患者病理分期和预后相关性

多因素分析显示：GKN2、CCL17表达通过影响患者淋巴结转移情况、肿瘤直径及浸润程度，从而影响病理分期，也影响着预后(P<0.05)，见表3。

表3 GKN2、CCL17表达与胃癌患者病理分期和预后的相关性

3 讨论

胃癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，我国也属胃癌高发的国家，病死率占各种恶性肿瘤之首[12]。本病任何年龄均可发生，但好发于中年男性，40～60岁年龄组约占全部病例的三分之二，男女之比2～3 ∶1[13]。孙珂等[14]发现胃癌的主要是由于幽门螺杆菌感染导致发生炎症反应，根据幽门螺杆菌感染后严重程度，逐渐发展为胃炎、胃溃疡到胃癌。目前，对于患者诊断及预后指标不仅限于宏观肿瘤病理指标，相关微观生物学指标逐渐开始占据一席之地，其相关微观生物学指标的具体量化表达，更直观、详细、具体[15]。患者体内任何一个生物学指标的微量变化都能够被精确检测，并根据检测结果推断患者所处的病理时间段及病理原因，更详细具体的检测结果也能够为患者提供更具有针对性及精确性的治疗方案。缩小了对患者治疗的治疗面，更为针对性及准确性的治疗方式及治疗药物也能发挥更有效、更稳定、更快速的临床疗效。能够为胃癌诊断及治疗和预后相关医学知识的扩展及医学技术的进步提供微观生物学方面的理论依据。

CCL17是一种单核/巨噬细胞趋化因子，属于CC趋化因子亚族，趋化因子在炎症反应中其关键作用，可以因应对细菌感染、病毒感染由多种细胞释放，释放通常由炎症细胞因子如白细胞介素1 刺激引起[16]。能够吸引单核/巨噬细胞到炎症部位，其主要作用是作为白细胞的趋化剂，从血液中吸引单核细胞、中性粒巨噬细胞和其他效应细胞到感染或组织损伤的部位引起免疫应答[17]。胃动蛋白是一种在胃部能够特异性表达的肿瘤抑制因子，能够在胃部发生感染时，通过保护胃黏膜、促进胃黏膜修复达到保护胃部的作用，作为一种抑癌基因，能够抑制癌症的发生及发展，GKN2就是其中一种[18]。临床实验结果显示，观察组GKN2表达水平显著低于对照组；观察组CCL17表达水平显著高于对照组；提示GKN2、CCL17表达水平与患者胃癌发生密切相关。结果显示，GKN2、CCL17表达水平与患者淋巴结转移情况、肿瘤直径、浸润程度及一年内生存率及复发率关系显著相关，表明GKN2、CCL17表达水平通过影响胃癌淋巴结转移情况、肿瘤直径、浸润程度等参与了胃癌的发展过程。GKN2能够通过减少胃癌细胞在增殖过程中所需的细胞周期蛋白D1及E1和基质金属蛋白酶9，将胃癌细胞迁移增殖过程停留在G1～S分裂期，在胃癌发展中起抑制作用[19]。CCL17在胃癌发展中起促进作用，研究显示，CCL17能够与其受体CC趋化因子受体4(CC chemokine receptor 4，CCR4)发生特异性结合，引起Treg细胞和Th17细胞在肿瘤微环境聚集，过度聚集会引起免疫反应中的T淋巴细胞抑制，进而增加幽门螺杆菌感染的几率及严重程度，进而加重患者炎症反应，引起CCL17趋化作用，形成恶性循环[20]。所以GKN2、CCL17表达水平也能够作为胃癌患者预后的指标。多因素分析结果显示，GKN2低表达、CCL17高表达是影响胃癌病理分期及预后的显著危险因素。

综上所述，GKN2低表达、CCL17高表达能够用来作为判定胃癌病理分期的相关生物学指标，也是影响胃癌预后的显著危险因素。