发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系的建立

罗 萍 张昊楠 徐建民 胡 冰 王晓萍 李光友 范春节*

（1. 林木遗传育种国家重点实验室，国家林业和草原局热带林木培育重点实验室中国林业科学研究院热带林业研究所，广州 510520；2. 南京林业大学，南京 210037；3. 林木遗传育种国家重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040）

桉树（spp.）是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（）的总称，原产澳大利亚及其附近岛屿。由于桉树具有速生丰产、材质优良、适应性广等优良特性，因此广泛种植于热带和亚热带地区，是世界四大速生造林树种之一，也是我国华南地区主要造林树种之一。尾巨桉（×）是尾叶桉（.）与巨桉（.）的杂交种，具有明显的杂种优势，其树干通直均匀、轮伐周期短以及出材率高，是我国桉树人工林的主栽品种。

近年来，植物基因工程技术在林木育种中被广泛应用，弥补了常规育种周期长、定向改良难以控制、远缘杂交或物种间杂交几乎难以实现的不足。目前，不同桉树品种已成功建立了农杆菌（）介导的遗传转化体系，如赤桉（）、蓝桉（）、尾叶桉等。部分研究获得了与开花、材性、抗性等相关的转基因株系并进行了田间试验。尽管如此，以根癌农杆菌（）介导法进行桉树遗传转化存在着转化效率低、稳定性差、转化系统冗长耗时等问题，难以建立快速、高效的根癌农杆菌介导的遗传转化体系，严重影响了桉树的进一步遗传改良和基因功能鉴定的进一步发展。而发根农杆菌（）介导的遗传转化可以从外植体组织中快速、高效地诱导出大量的毛状根。诱导的转基因毛状根可以用来开展体内基因功能表征的研究，如亚细胞定位/双分子荧光互补以及特定基因的功能鉴定。另外，这种转基因体系也可以与常规基因工程方法，如过表达、基因沉默、基因编辑工具CRISPR/Cas9 等技术相结合。此外，通过载体优化以及激素配比等方法在棉花（）、蒺藜苜蓿（）等植物中进行转基因毛状根的不定芽诱导，从获得的转基因组织中直接再生出完整的转基因植株，这为发根农杆菌转化体系的应用进一步拓宽了范围。

关于发根农杆菌介导的桉树毛状根转化体系仅少量报道，且由于不同的桉树种和无性系遗传背景不一致，导致遗传方法也有所差异，而对于我国华南地区广泛种植的栽培品种尾巨桉的遗传转化体系国内未见报道。因此，建立一个高效稳定的发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系进一步开展桉树木质素合成、次生代谢产物合成等相关基因功能的鉴定显得尤为重要。在本研究中，以华南地区广泛种植的尾巨桉优良无性系DH3229 为外植体材料，通过筛选外植体和农杆菌菌株等重要因素开展毛状根诱导，以期建立发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系，为今后开展桉树特定基因功能的鉴定和桉树的遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以尾巨桉（×）优良无性系DH3229的无菌苗为材料，在添加0.5 mg·L6-苄氨基嘌呤（6-BA）和0.1 mg·Lα-萘乙酸（NAA）的MS 基本培养基中继代培养20～25 d，培养条件为光照时间16 h·d，光照强度100 μmol·m·s，培养温度（25±2）℃。分别选取生长健壮，高度超过2 cm 的芽苗上的叶片和茎段为外植体材料，其中叶片选取完全舒展的叶片，茎段选取茎部节间，切除两端腋芽。试验所用材料由中国林业科学研究院热带林业研究所保存培养。

卡那霉素（Kanamycin，KM）、链霉素（Strepto⁃mycin，Strep）、头孢噻肟钠（Cefotaxime sodium，Cef）和Wood Plant Medium（WPM）均购自Duchefa 公司，GUS 染色试剂盒购自北京华越洋生物技术有限公司，发根农杆菌感受态细胞均购自上海唯地生物技术有限公司，植物表达载体pBI121 为本实验室保存，该载体含有35 S 启动子，NOS 终止子，基因（卡那霉素抗性基因）和基因（编码-葡萄糖醛酸苷酶基因）。发根农杆菌的培养采用TY培养基（3 g·L酵母提取物+5 g·L蛋白胨+10 μmol·L氯化钙，pH7.0），悬浮液（WPM+30 g·L蔗糖），共培养基（WPM+30 g·L蔗糖+6 g·L琼脂），毛状根诱导培养基（WPM+30 g·L蔗糖+2.5 mg·L聚乙烯吡咯烷酮PVP10+2 g·L交联聚乙烯吡咯烷酮PVPP+0.8 g·L水解酪蛋白+200 mg·LCef+6 g·L琼脂），悬浮液和培养基pH 值调整到5.8，然后高温高压灭菌备用。

1.2 方法

选取ArA4、Ar1193、K599、MSU440、ArQual 共5 种野生型发根农杆菌菌株进行测试。取保存的发根农杆菌菌液，划平板后挑取单菌落，分别接种至加有不同抗生素的TY 液体培养基中（见表1）。在28 ℃，200 r·min的恒温摇床中培养过夜，4 000×离心10 min 收集菌液，弃上清，加入等体积的悬浮液，待侵染。

表1 发根农杆菌类型及抗性Table 1 A.rhizogenes strain and antibiotics

取培养20～25 d 的增殖苗叶片和茎段为外植体，在外植体表面轻轻划1～2 道伤口，置于含有农杆菌的悬浮液中30 min，每隔5 min 震荡一次。然后取出侵染后的外植体，使用无菌滤纸吸干表面菌液，放置于共培养培养基上暗培3 d，培养温度为（25±2）℃。随后将外植体转移到毛状根诱导培养基中，在光照时间为16 h·d，光照强度100 μmol·m·s，以及培养温度为（25±2）℃的条件下培养2～3 个星期，统计毛状根诱导率，计算公式如下：

诱导率=产生毛状根的外植体数量/总外植体数量×100%

采用电转法将pBI121 质粒转入发根农杆菌MSU440 的感受态细胞中，加入600 μL 无抗生素的TY 培养基，28 ℃恒温，200 r·min振荡培养2～3 h，然后4 000×离心1 min 收集菌液，留取100 μL上清轻轻吹打混匀后涂布于附加有50 mg·L卡那霉素及50 mg·L链霉素的TY 固体培养基，28 ℃倒置培养2～3 d，挑取单克隆进行PCR 鉴定获得阳性克隆，摇菌后保存备用。

将携带有质粒pBI121 的发根农杆菌MSU440摇菌培养，待菌液浓度分别为OD=0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 时对叶片进行侵染，经过共培养和筛选培养后，3 个星期后诱导出毛状根，然后取出毛状根进行GUS 染色分析。每个处理5 个重复，每个重复20～25 个外植体。将携带有质粒pBI121 的发根农杆菌MSU440 摇菌培养，待菌液浓度分别为OD=0.3 时分别侵染叶片10、30、50、70、90 min，经过共培养和筛选培养后，3个星期后诱导出毛状根，然后取出毛状根进行GUS 染色分析。每个处理5个重复，每个重复20～25个外植体。

在毛状根诱导培养基中分别加入100、200、300、400、500 mg·L的Cef，3个星期后统计叶片毛状根诱导率和毛状根根长，确定抑菌剂对毛状根诱导的影响。每个处理5 个重复，每个重复20～25个外植体。在毛状根诱导培养基中分别加入0、10、15、20、25、30 mg·L的KM，3 个星期后统计叶片毛状根诱导率和毛状根根长，确定合适的筛选浓度。每个处理5 个重复，每个重复20～25 个外植体。

将获得的所有毛状根置于加有5-溴-4-氯-3-吲哚---葡萄糖苷酸（X-gluc）染液的离心管中，37 ℃避光保温12～24 h，观察显色反应，统计染色率。以野生型菌株MSU440 侵染的毛状根作为阴性对照，并计算阳性转化率，计算公式如下：

阳性转化率=染上蓝色毛状根数量/染色总数量×100%

选取抗性平板上的毛状根，采用CTAB法提取毛状根DNA，利用特异性引物基因和基因确定诱导出来的根是否为毛状根，使用基因和基因引物进行PCR 检测确定报告基因是否稳定整合到毛状根中（见表2）。

表2 引物列表Table 2 Primer sequence

1.3 数据统计分析

采用Excel 进行相关试验的数据记录以及柱状图的绘制，采用SPSS 分析软件进行单方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比较（=0.05），其中所有百分数要先经平方根反正弦化处理再进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同菌株和外植体对桉树毛状根诱导的影响

不同的发根农杆菌菌株对植物毛状根的诱导能力存在差异。本研究中共选取5 种不同类型的发根农杆菌包括ArA4、Ar1193、K599、MSU440、Ar⁃Qual（见表1），分别以叶片和茎段为外植体进行试验。如图1所示，不同发根农杆菌菌株对桉树毛状根的诱导呈现出明显的差异，其中ArA4 和MSU440 菌株可以诱导出大量的毛状根（见图1：D，E），而K599 几乎没有毛状根。与茎段相比，叶片为外植体材料时能够获得更高的毛状根诱导。进一步统计分析发现，以叶片为外植体时MSU440和ArA4 毛状根诱导率较高分别为81.0% 和79.1%。与叶片略微不同，以茎段为外植体，ArA4诱导率最高，为59.2%，其次是MSU440，诱导率为25.4%（见图2A）。通过对毛状根根长的测定，发现Ar1193 诱导的毛状根平均长度最长，为5.23 cm，其次是MSU440 和ArA4 分别为3.23、3.20 cm（见图2B）。综合毛状根诱导率、毛状根根长和形态的比较分析，在后期的试验中，采用发根农杆菌MSU440 为侵染菌株，以叶片为受体材料，进行进一步转化体系的优化。

图1 不同发根农杆菌诱导的毛状根A～F 分别为对照、Ar1193、ArQual、ArA4、MSU440、K599，受体材料为叶片；G～L 分别为对照、Ar1193、ArQual、ArA4、MSU440、K599，受体材料为茎段Fig.1 Hairy roots induced by different A.rhizogenes A−F represent control，Ar1193，ArQual，ArA4，MSU440，K599，respectively，the leaves were used as receptor material；G−L represent control，Ar1193，ArQual，ArA4，MSU440，K599，respectively，the stem segments were used as receptor material

图2 不同菌株和外植体对毛状根的影响Fig.2 Effectsofdifferentstrainsandexplantsonhairyroots

2.2 毛状根诱导和转化体系的优化

农杆菌的菌液浓度在一定的程度上能影响发根农杆菌的侵染效率。结果如图3A～E 所示，菌液浓度显著影响了毛状根的诱导率和转化率。菌液浓度在OD=0.1～0.9 范围内毛状根诱导率及阳性转化率都呈现出先上升后下降的趋势（见图4A）。当OD为0.3 时，毛状根诱导率达到峰值，为24.6%，显著高于其他处理；其毛状根阳性转化率在OD为0.3 时也达到了峰值，其阳性率为20.5%，与其他处理组也存在着显著性差异。与MSU440野生型农杆菌相比，含有质粒的农杆菌其毛状根诱导率大大下降，这可能与外源基因的插入以及诱导培养基中抗生素的加入有关。因此，综合毛状根诱导率以及阳性毛状根诱导率比较分析，选取OD为0.3为最佳侵染浓度。

同时开展了不同侵染时间对毛状根诱导率和转化率的影响研究，结果如图3F～J 所示。结果表明在一定的侵染时间范围内，毛状根诱导率和阳性转化率呈现出先升高后降低的趋势（见图4B）。当侵染时间为30 min 时毛状根诱导率最高，为23.2%，且与其他处理相比存在着显著的差异性。与毛状根诱导率相似，对毛状根阳性转化率的统计结果分析发现侵染30 min 时毛状根阳性转化率也达到了峰值，为20.2%，且与其他处理相比存在着显著的差异性。因此，综合毛状根诱导率和阳性毛状根诱导率比较分析，发现侵染30 min 可达到最佳的遗传转化效果，选定为最佳侵染时间。

图3 菌液浓度和侵染时间对转基因毛状根诱导率的影响A～E分别为农杆菌菌液吸光值OD600为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9；F～J分别为侵染时间10、30、50、70、90 minFig.3 Effects of bacterial concentration and infection time on the induction rate of transgenic hairy roots A−E represent the Agrobacterium concentration，which OD600 reaches 0.1，0.3，0.5，0.7 and 0.9 respectively；F−J represent the infection time of 10，30，50，70 and 90 min，respectively

图4 菌液浓度和侵染时间对转基因毛状根诱导率的影响Fig.4 Effects of bacterial concentration and infection time on the induction rate of transgenic hairy roots

2.3 抗生素对毛状根诱导的影响

为了抑制农杆菌的生长需加入适量的抑菌生长素，同时抑菌剂的添加可能会对毛状根的诱导和生长产生影响，为了确定抑菌抗生素是否对毛状根的生长造成影响。本研究中，在诱导培养基中添加不同质量浓度的Cef 进行确定合适的抑菌剂浓度。结果表明：在一定的质量浓度范围内，不同质量浓度的Cef 对尾巨桉叶片毛状根诱导率和毛状根根长的影响差异不显著（见图5）。在添加量为200 mg·L时，培养基中的农杆菌在一定时间范围内基本受到抑制。综合毛状根诱导率及表型和经济效益考虑，确定最适的Cef 抑菌浓度为200 mg·L。

图5 Cef质量浓度对毛状根诱导率（A）和毛状根根长（B）的影响Fig.5 Effect of cefotaxime sodium concentration on inducing rate（A）and length of hairy roots（B）

在此基础上，将桉树叶片分别接种于含有不同卡那霉素浓度的毛状根诱导培养基中，以确定合适的KM 筛选压。结果表明，KM 浓度显著影响了毛状根的诱导率和毛状根根长（见图6）。与对照相比，随着卡那霉素浓度增加，毛状根生长明显受到抑制，且毛状根长度明显变短，当浓度为20 mg·L时，毛状根生长完全被抑制。因此，20 mg·L卡那霉素浓度为筛选转基因毛状根的最适浓度。

图6 卡那霉素对毛状根诱导率（A）和毛状根根长（B）的影响Fig.6 Effect of kanamycin concentration on inducing rate（A）and length of hairy roots（B）

2.4 转基因毛状根的获得与鉴定

在建立起的毛状根诱导和转化体系的基础上，通过抗生素筛选后获得大量的毛状根，为进一步验证GUS等外源基因是否整合到发根农杆菌诱导形成的桉树毛状根基因组中，选取卡那霉素抗性平板上生长的毛状根，进行GUS 组织化学染色（见图7A）。另外提取抗性板上的毛状根基因组DNA，并利用特异性引物PCR（见表2）分别检测、、和基因。由图7B、C 可知，和基因已经整合到桉树毛状根中。进一步采用和基因检测表明外源的基因已稳定整合到毛状根的基因组中。经卡那霉素筛选后获得了23.2%的毛状根诱导率，其中87.1%发生了显色反应，转化率为20.2%。

图7 桉树毛状根的诱导过程简易图以及转基因毛状根的GUS组织化学染色分析（A）和PCR分子鉴定（B～C）A.1～2 为阴性对照；3～5 为阳性毛状根；图B～C 中1，5 为阳性对照，2，6 为阴性对照（野生型菌株侵染得到的毛状根），3，7 为ddH2O（阴性对照），4，8为抗性板上诱导的毛状根；B.分别检测rola，rolb；C.分别检测NPTⅡ，GUS Fig.7 Chart of Eucalyptus hairy root and GUS histochemical staining analysis（A）and molecular analysis of hairy roots（B～C）A.1−2 are negative controls；3−5 are positive hairy roots；In figures B and C，1，5 are positive controls，2，6 are negative control（shairy roots infected by wild-type strains），3，7 are ddH2O（negative control），4，8 are hairy roots induced on the resistant plate；B detects rola and rolb genes respective⁃ly；C detects NPTⅡand GUS genes respectively

3 讨论

由于发根农杆菌介导的遗传转化体系具有便利性和高效性，目前在多种植物中开展应用，尤其是在缺乏高效稳定遗传转化体系的非模式物种以及生长周期较长，转化困难的木本植物中，已有不少报道。例如Meng 等在木豆（）中利用发根农杆菌诱导的转基因毛状根作为试验材料，采用双分子荧光互补分析验证CBLs 与CIPKs相互作用。Plasencia 等在巨桉中利用发根农杆菌A4RS 诱导巨桉生成毛状根对木质素生物合成的基因CCR1进行功能分析。由此可见，利用发根农杆菌介导的遗传转化系统为基因功能的鉴定提供了一条新途径。

发根农杆菌介导的遗传转化体系的建立受许多因素的影响，包括菌株类型、外植体类型、菌液浓度和侵染时间等。发根农杆菌侵染植物的受伤部位后，会将其Ri质粒的T-DNA 区的DNA 片段插入并整合至宿主细胞的基因组，因此，不同Ri质粒类型的发根农杆菌具有不同的致根能力。本研究中无论以桉树叶片还是茎段为外植体时，黄瓜碱型K599 菌株无法诱导其毛状根形成，这与Meng等发现K599广泛适用于多种植物的结果有所不同，可能是由于不同物种之间的差异。而另外4种农杆碱型菌株均有一定的诱导毛状根的能力，其中MSU440 诱导毛状根的能力高于其他3 种农杆碱型菌株，且毛状根生长粗壮、状态较好，是开展尾巨桉发根农杆菌转化的首选菌株。肖璇在建立甜橙（）的遗传转化体系中表明MSU440诱导的毛状根效果最好，其毛状根转化效率高达68.3%。Gharari 等使用MSU440 对黄芩（）的茎段外植体进行注射时发现其转化频率可达100%，与本研究采用的菌株一致。

外植体类型是毛状根遗传转化过程中的一大重要因素。本研究选用叶片和茎段作为外植体材料，尽管不同农杆菌菌株在毛状根诱导率上存在一定的差异，但是不管使用哪种菌株都是叶片较茎段更为敏感，诱导率较高。与之相似，刘雪羽等在建立发根农杆菌介导光皮桦（）的遗传转化体系中表明，叶片作为外植体能够获得较高的转化效率，其转化率为36.4%，高于茎段和种子苗下胚轴。赖家业等在建立的根癌农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系中发现，茎段诱导的愈伤组织质量较高，可再分化出不定芽，并保持较高的分化率。主要原因可能是由于不同品种之间的差异，也有可能是根癌农杆菌与发根农杆菌对外植体的敏感程度不同造成的。

另外菌液浓度和侵染时间也是影响转化效率的重要因素。本研究结果表明在菌液OD为0.3、侵染时间为30 min，以及叶片为外植体时毛状根的诱导率及转化率最高，这与刘思巧在研究发根农杆菌介导银杏（）毛状根培养中得出的结论相似。丁雪在建立银中杨（×）的遗传转化体系中也表明最佳侵染时间为30 min，其转化效率达到了57.0%。主要原因可能是菌液浓度过低或侵染时间过短时农杆菌可能无法大量吸附于外植体细胞壁，从而导致外源基因无法整合到植物中。而当农杆菌菌液浓度过高或侵染时间较长时，大量农杆菌附着于外植体表面，共培养过程中农杆菌大量繁殖导致后期脱菌困难，引起植物褐化死亡，导致毛状根诱导率及转化率均降低。

获得KM 的最适筛选压是植物遗传转化过程中十分关键的步骤，是获得转基因毛状根的重要因素。本试验中以无性系尾巨桉DH3229 的叶片作为外植体，在KM 浓度为20 mg·L时，毛状根生长完全被抑制。这与周利建等在建立根癌农杆菌介导的巨尾桉遗传转化体系过程中的研究结果相同。根据其他研究者的试验结果可知不同品系的桉树筛选压大小会有较大差别。Mullin 等在研究赤桉的报告中表明，9 mg·L的KM 能抑制未转化外植体再生出植株，10 mg·L的KM能抑制根的生长。而蓝桉具有较高的KM抗性，愈伤组织在KM浓度75～100 mg·L时仍然有植株再生。

4 结论

本研究以尾巨桉优良无性系DH3229 为外植体材料，分别优化了发根农杆菌菌株、外植体材料以及菌液浓度等因素，并通过GUS 染色分析和PCR 分子检测证实该体系可以稳定获得转基因毛状根，其转化效率为20.2%。但是诱导率和转化率都有待进一步提高，可以从其他因素来进一步完善遗传转化体系，例如酚类物质乙酰丁香酮的添加以及基本培养基的选择等。本研究建立的转基因毛状根体系为今后尾巨桉优良无性系DH3229优良基因的挖掘奠定基础。同时，也为后续利用毛状根诱导完整的转基因再生植株提供稳定的材料。