病毒性毛细支气管炎患儿血清白细胞介素-6、酪氨酸激酶/信号传导及转录激活因子信号通路与免疫功能的关系

王雅宁, 崔立业, 陈翼霖, 贾宏超

(1. 河北省保定市第一中心医院东院 检验科, 河北 保定, 071000;2. 河北省保定市中心血站 检验科, 河北 保定, 071000; 3. 河北省望都县医院 检验科, 河北 保定, 071003)

毛细支气管炎是临床常见的以婴幼儿为发病高峰的呼吸道感染性疾病，多由病毒感染引起，早期治疗不及时可迁延发展，并与成年哮喘有紧密联系[1]。临床治疗以抗病毒、抗感染、营养支持、雾化吸入以及对症处理为主，目前缺乏更高效的干预靶点，究其原因为疾病发生的确切机制仍不十分清楚。既往研究[2-3]提出，机体防御机制不完善、早产、人工喂养、环境刺激、发育异常、病毒感染、炎症反应等均可能参与了毛细支气管炎的发生和发展过程，但是缺乏统一认识，还有待进一步探讨。近期研究[4-5]发现，由病毒感染诱发机体炎症反应紊乱和免疫功能障碍可能在毛细支气管炎的发生以及疾病转归中扮演重要角色。白细胞介素(IL)-6作为机体重要的促炎介质，在介导瀑布样炎症级联反应中发挥关键作用[6]。同时，细胞内酪氨酸激酶/信号传导及转录激活因子(JAK/STAT)信号通路可能是IL-6发挥促炎作用的重要“桥梁”[7], 但目前还缺乏此方面的基础和临床研究。因此，本研究以收治的病毒性毛细支气管炎患儿为研究对象，探讨患儿外周血清IL-6和JAK/STAT信号通路分子的表达以及免疫功能变化的临床意义，为疾病治疗新靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用随机法选择2019年9月—2021年3月入院首次确诊为病毒性毛细支气管炎的患儿112例为研究对象，其中轻度50例(轻度组)、中度40例(中度组)、重度22例(重度组)。呼吸危重评定量表评分<4分为轻度, 4～8分为中度, >8分为重度[8]。纳入标准: ① 年龄>1个月者; ② 符合毛细支气管炎的诊断标准[8]者，血清病毒抗原和病原学检测符合病毒感染的证据，如呼吸道合胞病毒; ③ 病程<7 d者; ④ 患儿经临床治疗均康复出院。排除标准: ① 患儿先天发育异常、围产期并发症、免疫功能障碍; ② 抽血困难患儿。另外选择30例健康儿童作为对照组。该研究取得受试者监护人的知情同意和医学伦理审批。轻度组男28例，女22例; 年龄5个月～3岁，中位年龄1.8岁; 体质量6～14 kg, 平均(10.5±3.6) kg。中度组男22例，女18例; 年龄3个月～4岁，中位年龄1.6岁; 体质量4～19 kg, 平均(11.6±3.9) kg。重度组男12例，女10例; 年龄4个月～3.5岁，中位年龄1.5岁; 体质量4.6～17.0 kg, 平均(10.7±3.7) kg。对照组男16例，女14例; 年龄5个月～3.5岁，中位年龄1.9岁; 体质量6.5～20.0 kg, 平均(12.2±4.2) kg。各组性别、年龄和体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

毛细支气管炎患儿入院24 h内用药，治疗前抽取外周静脉血5 mL, 对照组抽取空腹外周静脉血5 mL, 经室温静置后以2 000转/min离心10 min, 分别分装上清液和下层细胞沉淀，于-80 ℃保存集中送检。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6, Western blot法检测外周血单个核细胞(PBMCs)中磷酸化酪氨酸激酶 (p-JAK)、磷酸化信号转导激活转录因子 (p-STAT)蛋白相对表达量，免疫透射比浊法检测血清免疫球蛋白(Ig)A(IgA)、IgG和IgM, 流式细胞术检测CD4+和CD8+百分比。IL-6试剂盒购自美国Sigma公司, IgA、IgG和IgM试剂盒购自美国Beckman Coulter公司，流式细胞仪购自美国BD公司，根据说明书步骤进行，同批次试剂间变异以及不同批次间变异度均小于10%。每例样本均分别独立检测3次，结果取平均值。由副高以上专职人员独立完成。

PBMCs采用密度梯度离心法进行层析、分离并提纯，加入含胎牛血清的RPMI-1640液重悬，调整细胞浓度为1×106个/mL; 然后接种于6孔板上，每孔1 mL, 每组设置3个复孔; 将细胞培养板置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养6 h, 结束后用PBS液洗涤2次，每次10 min; 每孔加入200 μL蛋白裂解液置于冰上孵育，然后12 000转/min离心30 min得到上清液即总蛋白。取10 μL样品蛋白加入PBS液稀释至总体积100 μL, 调整终浓度为0.5 mg/mL; 向酶标孔中加入BCA工作液200 μL摇匀静置30 min; 然后1 h内在酶标仪上测定吸光度值，绘制标准曲线并计算蛋白浓度。根据电白电泳程序完成蛋白电泳、带电转膜、封闭抗体，滴加兔抗人p-JAK和p-STAT一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后滴加羊抗兔二抗室温下孵育1 h; 最后加入显色液显影，拍照保存，以目标蛋白与内参蛋白β-actin电泳条带的灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量，采用Image J软件自动分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素ANOVA分析，两两组间比较采用LSD-t法检验; 计数资料的比较采用χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IL-6、p-JAK和p-STAT比较

与对照组比较，轻度组、中度组和重度组IL-6、p-JAK和p-STAT升高，差异有统计学意义(P<0.05); 重度组IL-6、p-JAK和p-STAT水平高于轻度组、中度组，差异有统计学意义(P<0.05); 轻度组和中度组上述指标比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。

表1 各组IL-6、p-JAK和p-STAT比较

2.2 IgA、IgG和IgM比较

与对照组比较，轻度组、中度组和重度组的IgA、IgG和IgM水平较低，差异有统计学意义(P<0.05); 与轻度组、中度组比较，重度组IgA、IgG和IgM水平降低，差异有统计学意义(P<0.05); 轻度组、中度组患儿上述指标差异无统计学意义(P>0.05), 见表2。

g/L

2.3 CD4+和CD8+百分比及CD4+/CD8+比较

与对照组比较，轻度组、中度组和重度组CD4+和CD8+百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与轻度组、中度组比较，重度组CD4+和CD8+百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05); 轻度组、中度组CD4+和CD8+百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各组间CD4+/CD8+比较，差异均无统计学意义(P>0.05), 见表3。

表3 各组CD4+和CD8+百分比及CD4+/CD8+比较

3 讨 论

毛细支气管炎的主要临床表现是喘憋和呼吸困难，病理显示其多累及肺泡和肺泡间质，也被称为喘憋性肺炎[9]。致病菌以呼吸道合胞病毒最常见，临床治疗以解除气管痉挛为主，治疗不及时极易形成重症肺炎、心力衰竭等严重并发症，危及患儿生命[10]。

本研究显示，轻度组、中度组IL-6、p-JAK和p-STAT表达高于对照组，重度组高于轻度组、中度组，提示IL-6和JAK/STAT信号通路激活可能参与了毛细支气管炎的发生和发展。但是，本研究不能明确IL-6和JAK/STAT是促进毛细支气管炎发生的前提，还是疾病发生过程中的一种表现，下一步可以通过复制毛细支气管炎动物模型来分析内在作用机制。BERTRAND P等[11]通过提取毛细支气管炎患儿的鼻咽抽吸物和支气管肺泡灌洗液(BALF)检测发现, BALF中Th2细胞因子(IL-3、IL-4、IL-10和IL-13)、促炎细胞因子和趋化因子[IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和IL-8]水平高于对照组，并且IL-3和IL-12水平升高与反复喘息的发生有直接关系。BELACHEW N等[12]研究也表明，闭塞性细支气管炎(BO)患者的肺功能参数中用力肺活量、第1 秒用力呼气量、25%肺活量时最大呼气流速明显降低，肺清除指数显著高于健康对照组，除了总细胞和中性粒细胞数量增加引起的大量气道炎症外, IL-6和IL-8水平也显著升高，上述研究均提示，以ILs为核心的炎症反应在毛细支气管炎的发生中发挥重要作用。IL-6是十分重要的前沿促炎因子，不仅可以大量招募白细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞以及淋巴细胞向气道感染处聚集，而且可以进一步刺激炎症细胞大量释放CRP等炎症介质，诱导机体炎症不断升级，使疾病早期快速扩散，加快疾病进展[13-15]。

DONG M等[16]研究发现，在BO中miR-27a-3p的潜在作用靶点有Smad2和sprouty2, 并且可间接激活树突状细胞(DC)中的细胞外调节蛋白激酶(ERK), 增加IL-10的表达，进而通过正反馈环路即IL-10/JAK/STAT3途径维持DCs的未成熟状态，引起Foxp3+CD4+T细胞数量和转化生长因子(TGF)-β水平的增加。ZHU Z Z等[17]进行了一项多中心前瞻性队列研究，对毛细支气管炎患儿进行鼻咽气道代谢谱分析，证实毛细支气管炎是一种高度异质性疾病，与5岁时患哮喘风险有一定的纵向关系。

本研究显示，与对照组比较，轻度组、中度组和重度组CD4+和CD8+百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与轻度组、中度组比较，重度组CD4+和CD8+百分比降低，差异有统计学意义(P<0.05)。以上研究结果提示，毛细支气管炎患儿存在明显的体液和细胞免疫功能下降。PBMCs富含淋巴细胞和自然杀伤细胞，是参与机体免疫应答的重要细胞类型[18-19]。呼吸道病毒入侵并定植于气道上皮黏膜后，单核-巨噬细胞系统通过表面识别受体与病毒配体进行特异性结合，进而启动以体液和细胞免疫为主的主动应答过程[20-21]。单核-巨噬细胞表面可大量表达IL-6受体，与细胞外IL-6配对特异性结合，进而激活细胞内JAK/STAT信号通路，调节免疫细胞功能[22]。

综上所述，病毒性毛细支气管炎患儿体内IL-6高表达和JAK/STAT信号通路激活可能参与了病毒性毛细支气管炎的发生和发展，并与患儿的体液和细胞免疫功能紊乱密切相关，因此可为未来寻找疾病治疗新的干预靶点提供理论参考依据。