酶促水解结合响应面法优化复合花茶饮料工艺

汪洪涛，谢 微

(江苏经贸职业技术学院 a.健康学院；b.江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏 南京 211168)

枇杷花，又叫土冬花。黄酮类、多酚类、三萜酸类是枇杷花的主要有效成分[1-3]，具有抑菌、止咳、抗氧化、化痰、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等药用价值[4-6]。

石榴花含有多种活性成分，其中以多糖类[7]、多酚、类黄酮和萜类为主[8]。研究表明，这些成分具有抗氧化、降血糖、降血脂、预防或治疗冠心病等功效[9-11]。

罗汉果花是罗汉果的干燥雄花，含黄酮类化合物和多酚、糖类等活性成分，这些活性成分具有降血糖、抗炎症、清除亚硝酸盐、保护神经等生理功效[12-14]。

目前市场上饮料种类层出不穷，只有不断创新才能保证饮料产业的活力。天然健康的饮品需求逐渐成为各大品牌创新的推动力。本文以石榴花、罗汉果花和枇杷花为原料研制一款新型复合花茶饮料，通过酶促水解工艺提高活性物质的提取率，使复合花茶饮料具有多种保健功能。

1 材料与方法

1.1 主要材料

石榴花：购于山东；枇杷花：购于甘肃；罗汉果花：购于广西。原料花经挑选、清洗，于60 ℃下烘干至恒重，粉碎过40目筛，密封保存备用。

白砂糖：购于苏果超市；食品级纤维素酶(绿色木酶，1万U/g)：南京森贝伽生物科技有限公司；柠檬酸、山梨醇、抗坏血酸：均为食品级，浙江多味化工有限公司。

1.2 主要仪器

GZX—9140MBE型数显鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；FA1004B型电子分析天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；XMTD-204数显恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；FB-110Q高压均质机：上海励途超高压设备有限公司；SW-32D数显糖度计：广州市速为电子科技有限公司；SHB-III循环水多用途真空泵：上海比朗仪器有限公司。

1.3 加工工艺

1.3.1 工艺流程

复合花茶饮料加工工艺流程见图1。

图1 复合花茶饮料加工工艺流程

1.3.2 操作要点

原料酶促水解：分别称取一定量的三种原料花粗粉放入三个锥形瓶中，按一定量的料液比加入纯净水浸泡12 h，然后在恒温60 ℃的水浴锅内进行保温酶促水解，接着用循环水真空泵分别将三种花酶解液进行二次抽滤，合并滤液后定容备用。

调配：将三种酶促水解液按一定比例混合，添加适量的VC、山梨醇、柠檬酸、白砂糖，混合溶解后备用。

均质：将调配均匀的茶饮料在30 MPa压力下均质两次。

灭菌：用玻璃瓶灌装后，在90 ℃下杀菌10～15 min，冷却后即为成品。

1.4 试验方法

1.4.1 原料酶促水解液的制备

准确称取石榴花粉、罗汉果花粉和枇杷花粉各1 g，分别置于3个锥形瓶中，按1∶50(g/mL)的料液比向每个锥形瓶中加入纯净水，在室温且避光的条件下浸泡12 h。在酶的最适温度60 ℃、pH6.0条件下，加入一定量的复合纤维素酶(质量比3%)，保温酶促水解1 h。将三种酶促水解液进行二次抽滤，合并滤液后分别定容至100 mL，密封冷藏备用。最后将三种滤渣于105 ℃下烘干至恒重，分别计算出原料的利用率，公式如下：

原料的利用率(%)=

1.4.1.1 原料酶促水解液制备单因素实验

以原料利用率作为考察指标，其他条件不变，分别改变料液比(1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55 g/mL)、酶添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、酶促水解时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)，考察这些因素对原料利用率的影响。

1.4.1.2 原料酶促水解液制备响应面优化试验

在单因素实验基础上，以原料利用率作为考察指标，利用Design Expert 8.0响应面优化软件进行试验，确定石榴花、罗汉果花、枇杷花三种酶促水解液的最佳制备工艺参数。

1.4.2 花茶饮料配方的确定

1.4.2.1 花茶饮料基本配方

按比例量取三种酶促水解液进行混合，确保酶促水解液的总体积不变，加入纯净水定容到500 mL，然后加入0.3%山梨醇、0.02%抗坏血酸、5%白砂糖、0.04%柠檬酸，最后根据工艺流程制备饮料。

1.4.2.2 花茶饮料配方单因素实验

以感官评分作为考察指标，其他条件不变，分别改变白砂糖添加量、柠檬酸添加量和酶促水解液的比例，考察这些因素对饮料感官评分的影响。

1.4.2.3 花茶饮料配方响应面优化试验

在单因素实验基础上，利用响应面优化软件进行试验，确定复合花茶饮料的最佳配方。响应面优化试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken 设计因素水平

1.4.2.4 感官评分标准

结合本产品的特点，制定了复合花茶饮料感官评分标准。请10名不同年龄、性别的食品专业学生根据感官评分标准进行评分，最后取评分的平均值。感官评分标准见表2。

表2 感官评分标准

1.4.3 花茶饮料理化指标和微生物指标的测定

按照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》进行总酸的检测；采用SW-32D数显糖度计测定茶饮料中可溶性固形物含量；按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》、GB 29921—2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》测定饮料中相关微生物指标。

1.4.4 数据分析与处理

采用EXCEL2010软件和Design Expert 8.0软件对试验数据进行分析处理，每组试验重复3次(结果以平均值±标准差表示)。

2 结果与分析

2.1 原料酶促水解液的制备

根据单因素实验和响应面优化试验结果，分别得到三种原料酶促水解的最佳工艺参数和原料利用率，结果见表3。

表3 三种原料酶促水解的最佳工艺参数和原料利用率

由表3可知，石榴花的酶解时间最短，原料利用率最高，而枇杷花的原料利用率最低。出现此现象的主要原因是枇杷花的花茎较多，难以水解，而石榴花以花瓣为主，容易被酶水解。

2.2 花茶饮料配方的确定

2.2.1 白砂糖添加量对饮料感官评分的影响

在其他条件不变的情况下，将白砂糖添加量分别设定为1%、2%、3%、4%、5%进行实验，结果见图2。

图2 白砂糖添加量对饮料感官评分的影响

从图2可以看出，随着饮料含糖量的增加，感官评分也逐渐升高。白砂糖添加量为4%时，饮料甜度适当，口感清爽，感官评分最高。因此，选择白砂添加量3%、4%、5%作为响应面试验的水平参数。

2.2.2 柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响

在其他条件不变的情况下，将柠檬酸添加量分别设定为0.01%、0.025%、0.04%、0.055%、0.07%进行实验，结果见图3。

图3 柠檬酸添加量对饮料感官评分的影响

从图3可以看出，感官评分总体呈下降趋势。柠檬酸添加量为0.025%时，饮料酸甜可口，感官评分最高。因此，选择柠檬酸添加量0.01%、0.025%、0.04%作为响应面试验的水平参数。

2.2.3 酶促水解液比例对饮料感官评分的影响

在其他条件不变的情况下，将石榴花、罗汉果花、枇杷花的酶促水解液比例分别设定为2∶2∶2、1∶2∶3、1∶3∶2、2∶1∶3、3∶1∶2、3∶2∶1、2∶3∶1(mL∶mL∶mL)进行实验，结果见图4。

图4 酶促水解液比例对饮料感官评分的影响

从图4可以看出，石榴花、罗汉果花、枇杷花的酶促水解液比例为1∶3∶2时，感官评分最高。因此，选择酶促水解液比例1∶2∶3、1∶3∶2、2∶1∶3作为响应面试验因素的水平参数。

2.2.4 饮料配方的响应面试验结果及分析

饮料配方响应面优化试验方案及结果见表4。通过软件分析得出回归方程为：Y=92.00-1.75A+4.75B-1.25C-1.50AB-1.00AC+2.00BC-5.50A2-6.50B2-5.00C2。根据回归方程进行方差分析及显著性检验，结果见表5。

表4 饮料配方响应面优化试验方案及结果

表5 饮料配方响应面方差分析结果

由表5可知，模型F值为156.56，P<0.0001，说明二次项具有显著性差异和统计学意义。失拟项P为0.4789，说明失拟项与回归模型没有显著性差异。决定系数R2=0.9951，说明该模型能解释99.51%的响应值变化，拟合程度较好，可以采用此模型对饮料配方进行分析和预测。各因素对花茶饮料感官评分的影响从大到小依次为：B(白砂糖添加量)>A(酶促水解液比例)>C(柠檬酸添加量)。

酶解液比例、白砂糖添加量、柠檬酸添加量三因素的交互作用对饮料感官评分的影响见图5。

从图5可以看出：固定柠檬酸添加量，随着酶解液比例的改变和白砂糖添加量的增加，饮料感官评分先升高后降低；固定白砂糖添加量，随着酶解液比例的改变和柠檬酸添加量的增加，饮料感官评分先升高后降低；固定酶解液比例，随着柠檬酸和白砂糖添加量的增加，饮料感官评分先升高后降低；曲面坡度陡峭程度明显。

图5 三因素交互作用对饮料感官评分的影响

2.2.5 饮料配方的验证实验

利用响应面软件分析得出饮料的最佳配方：酶促水解液比例1∶3∶2，白砂糖添加量4.39%，柠檬酸添加量0.02%，饮料感官评分为93.11分。考虑到实际操作，将白砂糖添加量调整为4.5%，进行5次平行验证实验。最终得到的茶饮料感官评分为92.50分，和预测值相差很小，说明这个配方是可行的。

2.2.6 饮料质量指标分析

饮料相关指标检测结果见表6。复合花茶饮料总酸为5.23 g/L，可溶性固形物含量为7.85%，Vc为190.26 mg/L，富含多酚类和黄酮类活性成分；各项微生物指标均在国家标准的安全检出限内。

表6 饮料质量指标

3 结论

通过复合纤维素酶解工艺，提高了三种原料花的利用率，使酶解液中的活性成分充分溶出。通过单因素实验和响应面优化试验得出饮料的最佳配方：石榴花、罗汉果花、枇杷花的酶促水解液比例为1∶3∶2，再添加0.3%山梨醇、0.02%抗坏血酸、4.5%白砂糖、0.02%柠檬酸。复合花茶饮料色泽纯正、香味浓郁协调、酸甜可口、无沉淀析出，感官评分高达92.5分，并且富含黄酮类和多酚类活性成分。