非肌层浸润性膀胱癌微小RNA-138、微小RNA-143表达与患者预后的相关性分析

张 刚, 任衢军, 成泽民

(四川省达州市中心医院 泌尿外科, 四川 达州, 635000)

膀胱癌是临床常见的恶性肿瘤，多发于50～70岁人群，其中约75%为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)[1]。目前，经尿道膀胱肿瘤电切术被广泛应用于NMIBC的治疗中，其能将肉眼所见病灶切除，对NMIBC具有一定的治疗价值，但仍有50%～80%患者肿瘤复发，且约30%患者伴有肿瘤进展，严重影响预后[2]。相关研究[3]指出，膀胱癌发生与进展的机制非常复杂，筛选潜在肿瘤标记物以进一步明确膀胱癌的发病机制是临床研究的重点与难点，这对于膀胱癌的早期诊疗具有重要意义。微小核糖核酸(miRNA)是非编码RNA分子，这类分子能调控靶基因表达，参与细胞代谢、发育、凋亡、更新等过程，其异常改变与肿瘤疾病有关[4]。黄卓雅等[5]指出，微小RNA-138(miR-138)能对沉默信息调节因子1进行靶向调控，从而调节膀胱癌细胞凋亡与增殖。另有研究[6]提示，微小RNA-143(miR-143)基因多态性与膀胱癌发生风险有关，表明miR-143基因在膀胱癌中可能发挥重要的调节作用。miR-138、miR-143表达与NMIBC患者预后的关系目前尚未完全明确，本研究选取124例NMIBC患者为研究对象，探讨NMIBC组织中miR-138、miR-143表达与患者预后的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取达州市中心医院2015年6月—2018年6月收治的124例NMIBC患者作为研究对象，其中68例患者同时取癌组织与癌旁组织(距离病灶约3 cm)。纳入标准: ① 经病理诊断证实为NMIBC的成年患者; ② 既往无化学治疗、放射治疗、免疫治疗等干预史者; ③ 近期未使用过激素、免疫抑制剂者; ④ 能接受随访者; ⑤ 遵循自愿原则，签署同意书者。排除标准: ① 有恶性血液疾病或其他部位原发性肿瘤者; ② 伴尿出血、泌尿系统感染者; ③ 心、肝、肾等脏器功能不全者; ④ 因肿瘤复发入院者; ⑤ 既往有精神病史者。124例患者中，男101例，女23例; 年龄40～75岁，平均(60.15±12.86)岁; 有饮酒史33例，无饮酒史91例; 肿瘤分期为Ta期89例, T1期35例; 肿瘤直径≥3 cm者41例, <3 cm者83例; 高血压者21例，无高血压者103例; 单发肿瘤96例，多发肿瘤28例; 病理分级为高级别乳头状尿路上皮癌(UPC)26例、低级别UPC 42例、低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤(PUNLMP)56例。本研究方案获得达州市中心医院伦理委员会审核批准。

1.2 检测方法

通过手术获取患者膀胱癌组织、癌旁组织，采用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定miR-138、miR-143表达水平。主要仪器为分光光度计(U-T9型，屹谱仪器制造有限公司)、荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(MA-688型，江苏迅睿生物技术有限公司)、低温冰箱(DW-86L390型，南京贝登医疗股份有限公司)和高速离心机(TGL-16M型，博科集团)。主要材料为无水乙醇、三氯甲烷、琼脂糖、异丙醇、逆转录试剂盒，试剂盒购于美国Invitrogen公司。采用Trizol试剂提取总RNA，取少量RNA液测定纯度及浓度。使用逆转录试剂行反转录，合成cDNA。取5 μL cDNA行RT-PCR扩增，并使用荧光定量PCR仪与配套试剂进行检测。miR-138上游、下游引物序列分别为5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′、5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′; miR-143上游、下游引物序列分别为5′-TGAGATGAAGCACTGT-3′、5′-ACATCGACTGTAGCATA-3′; 内参引物U6的上游、下游引物序列分别为5′-CAGGGGCCATGCTAAATCTTC-3′、5′-CTTGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。反应条件: 95 ℃预变性15 min; 94 ℃变性15 s, 55 ℃退火30 s, 70 ℃延伸34 s, 40个循环。采用2-△△CT法表示miR-138、miR-143相对表达量。

1.3 随访方法

NMIBC患者术后均随访36个月，随访方式包括门诊随访、电话随访，且患者均遵医嘱定期门诊复查。观察并分析患者的无瘤生存率与累积生存率。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 NMIBC组织、癌旁组织miR-138、miR-143表达情况比较

NMIBC组织中miR-138、miR-143表达量均低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。

表1 NMIBC组织、癌旁组织miR-138、miR-143表达量比较

2.2 预后情况及预后单因素分析

本研究以术后出现复发、转移、死亡事件为预后不良，以无事件生存为预后良好。124例患者中，预后不良者38例、预后良好者86例，将其分别纳入预后不良组、预后良好组。miR-138、miR-143表达量以癌组织中表达量均值为界分成高表达(>均值)与低表达(≤均值)。预后不良组肿瘤T1期、肿瘤直径≥3 cm、多发肿瘤、高级别UPC占比均高于预后良好组, miR-138高表达率、miR-143高表达率均低于预后良好组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 124例NMIBC患者预后的单因素分析[n(%)]

2.3 预后的多元Cox回归分析

采用多元Cox回归模型对单因素分析中差异有统计学意义的变量进行量化赋值，并将其设为自变量X, 同时以预后为因变量Y(预后良好=0，预后不良=1)。多元Cox回归分析结果显示，肿瘤T1期、肿瘤直径≥3 cm、多发肿瘤、高级别UPC是预后的危险因素(P<0.05), 而miR-138高表达、miR-143高表达是预后的保护因素(P<0.05), 见表3。

表3 NMIBC患者预后的多元Cox回归分析

2.4 不同miR-138、miR-143表达患者的无瘤生存及累积生存情况

根据NMIBC组织中miR-138表达量的不同，将124例患者分成miR-138高表达组(n=69)、miR-138低表达组(n=55)。miR-138高表达组的无瘤生存率、累积生存率分别为82.61%(57/69)、88.41%(61/69)。miR-138低表达组的无瘤生存率、累积生存率分别为52.73%(29/55)、47.27%(26/55)。miR-138高表达组的无瘤生存率、累积生存率均高于低表达组，差异有统计学意义(χ2=12.652、14.911,P<0.01), 见图1。

A: 无瘤生存函数图; B: 累积生存函数图。

根据NMIBC组织中miR-143表达量的不同，将124例患者分成miR-143高表达组(n=64)、miR-143低表达组(n=60)。miR-143高表达组无瘤生存率、累积生存率分别为84.38%(54/64)、87.50%(56/64)。miR-143低表达组无瘤与累积生存率分别为53.33%(32/60)、61.67%(37/60)。miR-143高表达组的无瘤生存率、累积生存率均高于低表达组，差异有统计学意义(χ2=13.968、11.022,P<0.01), 见图2。

A: 无瘤生存函数图; B: 累积生存函数图。

2.5 NMIBC组织中miR-138与miR-143表达的一致性

Kappa检验结果显示, NMIBC组织中miR-138表达与miR-143表达具有高度一致性(Kappa=0.790,P<0.01), 见表4。

表4 NMIBC组织中miR-138表达与miR-143表达的一致性

3 讨 论

NMIBC是临床较常见的一种膀胱癌类型，多采用手术切除治疗，但这类肿瘤主要呈中心性生长，术后仍有部分患者出现复发、转移，导致死亡风险增加[7]。NMIBC的发病机制比较复杂，临床亟需进一步探索其发生与进展机制并寻找更好的预后评估指标，以便更有效地分析病情，改善患者预后。相关研究[8]证实, miRNA与肿瘤的发生和进展有关，其能通过对肿瘤微环境进行调控，参与肿瘤细胞分化、分泌、转移等过程，并调节肿瘤免疫系统，促进或抑制肿瘤进展。YANG R等[9]研究显示, miR-138-5p能靶向Survivin促进膀胱癌细胞的侵袭和增殖。WANG Y等[10]则认为, miR-138-5p表达下调与膀胱癌预后不良密切相关。由此推测, miR-138可能在膀胱癌中发挥重要调节作用，其表达异常或与患者病情进展有关。LI M S等[11]指出, Circ_0006332可通过调控miR-143表达对MYB家族成员MYBL2基因表达进行调节，参与膀胱癌进展，间接提示miR-143表达与膀胱癌有关。

miR-138在多种恶性肿瘤中呈异常表达，包括结直肠癌、鼻咽癌、膀胱癌等，其对肿瘤细胞的调控机制较复杂，在多数肿瘤中具有抑癌作用，能促进癌细胞凋亡，抑制其增殖[12]。王秋爽等[13]指出，miR-138能靶向细胞周期蛋白1对结肠癌患者肿瘤细胞增殖进行抑制，提示其具备抑癌功能。p53对miRNA表达有调控作用，其也受相关miRNA表达调控, p53介导的信号通路能促进癌细胞凋亡，而miR-138能靶向p53的3′-UTR区，致p53表达上调，诱导细胞凋亡，这可能是miR-138重要的抗癌机制[14]。动物实验[15]结果提示, miR-143位于染色体5q32处，具有抑癌作用，其表达受缺氧诱导因子-1α、p53蛋白调节，此外, miR-143还可能通过靶向大鼠肉瘤相关信号通路达到抑制癌症进展的目的。本研究结果显示, NMIBC组织中miR-138、miR-143表达量显著低于癌旁组织，表明患者机体的抗癌能力不足，会促进NMIBC癌细胞增殖与进展。

NMIBC患者的中远期预后情况已引起广泛关注，相关研究[16]提示, NMIBC患者预后大多与肿瘤分期、肿瘤数目、病理分级等有关。本研究结果显示, NMIBC患者预后与肿瘤分期、肿瘤直径、肿瘤数目、病理分级有关，与既往研究[17-18]结论相符。本研究还显示, miR-138高表达、miR-143高表达对患者预后有保护性作用，可提高患者无瘤生存率与累积生存率，且miR-138、miR-143在NMIBC组织中的表达存在高度一致性。SEGOVIA C等[19]指出，磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α的改变可致miR-138表达增加，有利于对NMIBC细胞进行抑制，进而可改善患者预后。KAMAL M T等[20]发现，膀胱癌患者血浆miR-143表达低于健康者，与本研究结论吻合，进一步提示低表达miR-143可能促进膀胱癌进展。本研究观察miR-138、miR-143在NMIBC组织中的表达情况，并分析二者与预后的关系以及二者表达的一致性，发现miR-138、miR-143在NMIBC中均有抑癌作用，且二者低表达可能共同促进癌细胞增殖。但本研究存在一定局限性，如样本选取范围偏小，且纳入患者大多来自当地，未来还需扩大病例选取范围，进一步分析不同地区患者间的miR-138、miR-143表达情况。

综上所述, miR-138、miR-143在NMIBC组织中均表达下调，二者低表达可导致患者预后不良, miR-138、miR-143有望成为NMIBC诊疗的新靶标。