Shine i2900 全自动化学发光免疫分析仪检测血栓分子标志物的性能评价

孙 聪，梅燕萍，崔薇薇，王一杉

（南京医科大学附属南京医院医学检验科，南京市第一医院医学检验科，南京 210006）

0 引言

血栓分子标志物包含血栓调节蛋白（TM）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物（TAT）、组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活抑制物-1 复合物（t-PAIC）及纤溶酶-α2 纤溶酶抑制物复合物（PIC），临床上常简称为血栓四项。TM 是由内皮细胞产生的跨膜糖蛋白，生理情况下，TM 通过抑制凝血酶原转化为凝血酶、捕获凝血酶使其失去活性并有效激活蛋白C（PC），放大PC 的抗凝效应来发挥抗凝作用。TM 分为固定型（膜型）和溶解型（血液型），固定型存在于细胞表面，而溶解型游离于血浆和尿液中[1]。TAT 为血液中凝血酶（相对不活跃）与抗凝血酶Ⅲ按1∶1 比例结合形成的复合物，在血液中半衰期较短，为3～15 min。TAT的显著增加说明机体内凝血系统被激活且处于高水平，提示血栓形成风险，可以较早反映人体凝血功能。t-PAIC 为组织型纤溶酶原激活物（t-PA）与纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）以1∶1 比例结合形成的复合物，是用于反映纤溶系统的标志物，其血浆浓度增高提示PAI-1 活性增加，主要反映内皮系统损伤（器官损伤性质）。PIC 是纤溶酶生成后与α2 纤溶酶抑制物以1∶1 比例结合形成的复合物，其半衰期为6 h，可以直接测量并间接反映纤溶酶的生成，弥补了纤溶酶半衰期短、不易检测的缺陷。在过去的几十年中，由于检测手段的局限，这些血栓分子标志物未能广泛应用于临床。随着科学技术的发展，将化学发光法应用于分子标志物的检测后，这些分子标志物在血栓性疾病的诊断、治疗及预后判断中具有更为广阔的临床应用前景。

我科于2021 年9月引进了一台广州万孚公司研发生产的Shine i2900 全自动化学发光免疫分析仪用于检测血栓四项。CNAS CL02：2012 文件要求，新的检测系统在投入使用前必须进行性能验证。本研究依据中国合格评定国家认可委员会制定的CNAS-GL037：2019《临床化学定量检验程序性能验证指南》，同时参考WS/T 492—2016[2]、WS/T 408—2012[3]、WS/T 402—2012[4]相关文件对该仪器检测血栓四项进行性能验证。

1 资料与方法

1.1 一般资料

5 例高值血浆样品来源于本院经影像学诊断有血栓形成的临床患者，健康人群的血浆样品来源于本院进行健康体检的人群。参考WS/T 402—2012 标准筛选参加体检人群，筛选标准为：（1）无各种急慢性疾病；（2）6 个月内未进行手术，4 个月内未献血、输血或大量失血，2 周内未服用药物；（3）无营养不良、素食、酗酒、嗜烟；（4）近期无剧烈运动或重体力劳动；（5）未处于妊娠或哺乳期；（6）实验室检查结果正常。

1.2 仪器与试剂

仪器：广州万孚公司Shine i2900 全自动化学发光免疫分析仪。磁微粒化学发光法试剂盒及质控品均为广州万孚公司生产，主要包括：TM 测定试剂盒（批号：W39121501F2900），TAT 测定试剂盒（批号：W39221601F2900），t-PAIC 测定试剂盒（批号：W39421601F2900），PIC 测定试剂盒（批号：W39321601F2900）；TM 质控品（批号：W85421601F2900），TAT 质控品（批号：W85521601F2900），t-PAIC 质控品（批号：W85721501F2900），PIC 质控品（批号：W85621501F2900）；TM、TAT、t-PAIC、PIC 校准品（批号：W39121601F2900、W39121501F2900）。

1.3 方法

1.3.1 精密度测试

精密度是保证所有性能验证试验正确进行的前提，因此精密度验证应放在其他性能验证之前，否则无法保证后续性能验证结果的可靠性[5]。选用广州万孚公司生产的血栓四项质控品，参考WS/T 492—2016行业标准进行精密度的评价。每天开机后确认仪器性能符合要求后进行测试。每天测定一批含2 个浓度的质控品，每个浓度连续测定3 次，由同一名工作人员连续测定5 d。分别计算出总均值、批内标准差、批间标准差、实验室内标准差，并据此计算实验室内变异系数（coefficient of variation，CV）。

1.3.2 正确度测试

在精密度测试满足要求的前提下，根据GL-037《临床化学定量检验程序性能验证指南》的要求，通过测定参考物质进行正确度验证，可通过计算与参考物质的偏倚来判断是否通过。本次测试通过测量2个浓度的厂商校准品来进行验证。

先使用批号为W39121601F2900 的校准品进行各检测项目的定标，再测定批号为W39121501 F2900的校准品进行正确度的验证。参考CNAS-GL039：2019 的要求，每天测定2 个浓度的校准品4 次，连续测定5 d。计算出均值，再通过公式：偏倚（%）=，计算出各项目测定均值与校准品参考值之间的偏倚。

1.3.3 线性范围测试

以WS/T 408—2012 为参考标准，采用多项式回归分析法进行线性范围验证，选择低浓度（L）和高浓度（H）患者标本各一份，按5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H 混合成6 个样本。每份混合样本测定3 次，取平均值作为测定值。将测定值用Grubbs 法进行离群点检查。如无离群点则采用SPSS 软件进行回归统计分析。如计算出的方程为线性方程时，再进行实验数据的精密度检查，检查公式为

1.3.4 临床可报告范围测试

选取线性范围附近的高浓度样本，用生理盐水分别按1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40 比例进行稀释，将配制好的样本重复检测2 次取平均值，同时计算出对应稀释倍数下的理论值。按回收率=（测定值-理论值）/理论值×100%的公式计算回收率，以回收率＜10%作为该稀释倍数下的测定结果可靠的判断标准。临床可报告范围的上限为线性范围上限乘以最大稀释倍数，下限为线性范围的下限。

1.3.5 参考区间验证

参考WS/T 402—2012 标准进行验证，筛选本院体检健康人群，按性别分成2 组，每组各20 名，其中男性组22～78 岁，女性组19～84 岁。每组数据先用Dixon 法进行离群点检查，如有90%的测量值落在参考区间内，则通过验证，否则应重新进行参考区间的确立测试。

1.3.6 稳定性测试

选取10 个不同浓度的样品，设置即刻检测、常温放置8 h 及2～4 ℃放置24 h 3 个条件分别对这10个样本进行测试。通过计算每个样本常温放置8 h结果、2～4 ℃放置24 h 结果与即刻检测结果的相对偏差来验证其稳定性。以相对偏差＜10%、总符合率≥90%为验证通过。

2 结果

2.1 精密度测试结果

2 个浓度质控品的检测结果显示，TM、TAT、PIC、t-PAIC 4 个项目实验室内CV 均小于2%，满足厂商宣称的（CV≤8%）要求，精密度较好。详见表1。

表1 精密度测试结果

2.2 正确度测试结果

通过测试计算出Shine i2900 全自动化学发光免疫分析仪检测TM、TAT、PIC、t-PAIC 4 个项目的偏倚范围为-7.04%～-2.07%，满足厂商要求（10%以内），正确度符合要求。详见表2。

表2 正确度测试结果

2.3 线性范围测试结果

根据WS/T 408—2012 要求，首先对Shine i2900全自动化学发光免疫分析仪检测每个项目得到的18 个数据进行离群点检查，结果见表3。

以显著水平σ=0.05，样本重复测定次数为3次，查Grubbs 临界值表得临界值为1.153[3]，而表3 中t1、t2均≤1.153，故判断数据无离群点，可用于进行多项式回归分析。

表3 离群点检查结果

通过表4～7 的数据分析，4 个检测项目的非线性系数二次回归多项式的b2、三次回归多项式的b2和b3与0 之间的差异无统计学意义（P＞0.05），故拒绝二次多项式及三次多项式，最适合的多项式均为一次多项式。按前述方法进行精密度检查结果均通过，证明本次线性范围测试精密度符合要求，且得出的线性范围与厂商宣称值基本一致。详见表8。

表4 TM 多项式回归分析结果

表8 精密度检查及线性范围结果

2.4 临床可报告范围测试结果

对高浓度样本进行稀释，计算回收率，结果显示TAT、TM、PIC、t-PAIC 4 个检测项目的最大稀释倍数均为40 倍。详见表9。

表9 最大稀释倍数结果

结合最大稀释倍数与线性范围结果可计算出血栓四项的可报告范围，即TM 为1.02～8001.20TU/mL，TAT为0.50～4800.00 ng/mL，PIC 为0.06～1617.20 μg/mL，t-PAIC 为0.50～4000.00 ng/mL。

表5 TAT 多项式回归分析结果

表6 PIC 多项式回归分析结果

2.5 参考区间验证结果

本次验证采用Dixon 法进行离群点检查，未发现存在离群点。TAT（女性）、PIC（女性）验证的符合率为90%，TAT（男性）、t-PAIC（女性）验证的符合率为95%，其余检测项目的符合率为100%，所有检测项目参考区间验证均符合要求。详见表10。

表10 参考区间验证结果

表7 t-PAIC 多项式回归分析结果

2.6 稳定性测试结果

10 份样本在常温8 h 和2～4 ℃24 h 下放置后，检测结果与即刻检测的结果进行比较，相对偏差均在10%以内，符合率为100%。详见表11～14。

表11 TM 稳定性测试结果

3 讨论

近年来，血栓性疾病的发病率越来越高，而血栓性疾病中，静脉血栓占有较高的比例。大部分的静脉血栓发病前都没有明显的症状，但静脉血栓常会引起肺栓塞，导致严重的后果。据《中国血栓性疾病防治指南》要求，预防静脉血栓的工作尤为重要[6]。当血浆TAT、PIC、TM、t-PAIC 水平升高时，可反映早期深静脉血栓形成发生时内皮细胞损伤和凝血纤溶系统失衡情况，这4项指标可作为影响孕中晚期静脉血栓发生的独立预测因子，联合检测可为临床早期诊断提供参考。血栓四项也可用于弥散性血管内凝血的早期检测。目前对弥散性血管内凝血的检测主要是以筛查为主，无法早期发现、分型。弥散性血管内凝血治疗效果判定的临床指标与原发性疾病症状是否改善很难区分，目前实验室检查指标主要是血小板计数、纤维蛋白原及纤维蛋白降解产物，这3 个指标的恢复比较慢，无法实时反映疾病状态。据多项研究表明，TM、PIC 和t-PAIC的水平升高可以早期预测脓毒症患者弥散性血管内凝血的发生，联合预测的价值优于单个检测，其中当TM＞11.5 TU/mL 时脓毒症患者死亡风险升高，联合序贯性器官衰竭评分（sequential organ failure assessment，SOFA）≥1 分可为诊断脓毒症相关性凝血病提供参考[7-8]。

Shine i2900 全自动化学发光免疫分析仪是基于磁微粒化学发光法进行血栓四项的检测，具有检测速度快、操作简便的特点，适合常规实验室开展。根据ISO 15189：2012 要求，实验室在引入新的检测系统前，需进行独立验证，应通过获取客观数据证实检验程序的性能与其声明相符。

本次实验参考WS/T 492—2016，选用2 个浓度的质控品进行精密度测试，得出血栓四项的实验室内CV 均小于2%。因该项目为新开展项目，卫生部临床检验中心尚未提供评价标准，故参考厂商说明书的声明值（CV≤8%），该仪器的精密度良好。之后通过测量2 个浓度的厂商校准品来进行正确度验证，4 个检测项目的偏倚为-7.04%～-2.07%，结果存在一定的负偏倚，偏倚度满足厂商要求，正确度也符合要求。

表12 TAT 稳定性测试结果

表13 PIC 稳定性测试结果

线性是指在给定的范围内，测定结果与检测分析物的量直接成比例的能力，实验室正确评价检测系统的线性范围才能保证检测结果的有效性。本次线性范围测试在验证实验数据无离群点存在的前提下，回归分析显示4 个检测项目均为一次多项式为最适多项式，实验数据的精密度检查也符合要求。本次验证的线性范围TM 为1.02～200.03 TU/mL，TAT 为0.50～120.00 ng/mL，PIC 为0.06～40.43 μg/mL，t-PAIC为0.50～100.00 ng/mL，与厂商宣称范围基本一致，可满足临床要求。

表14 t-PAIC 稳定性测试结果

可报告范围是检测方法所能定量报告的分析物值的范围，允许对样本进行稀释、浓缩或者其他预处理，扩展了患者结果的可报告范围，其上限的确定一般采用线性稀释回收法[9-12]。本次实验结果表明血栓四项最大稀释倍数均为40 倍，在最大稀释倍数时的可回收率均＜10%。以线性范围下限作为可报告范围的下限，线性范围上限和最大可稀释倍数的乘积作为可报告范围的上限，可得出Shine i2900 全自动化学发光免疫分析仪检测血栓四项的临床可报告范围。

本次实验从健康体检人群中按性别筛选出2组，每组20 人，进行了参考区间的验证。在排除离群点干扰的可能性后，有大于90%的结果落在厂商提供的参考区间内，证明厂商给出的参考区间在本实验室适用。

合格的血浆样本是保证检测结果准确可靠的前提，其受血液样本采集和处理的一系列环节（如采血器具的选择、抗凝剂的使用、采血技术、血浆样本的获取和样本的转运及保存等）影响。实验室进行常规凝血项目，如凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）等检测时均要求在常温条件下分离血浆，4 h 内完成检测[13]。血栓四项作为新型的血栓检测项目，对样本稳定性的要求未见相关报道。本次实验比对了常温放置8 h、2～4 ℃放置24 h 后与即刻检测的样本，比对结果的偏差均在10%以内。结果表明在上述存储条件下，用于血栓四项检测的样本性状稳定。

综上，本次性能评价从精密度、正确度、线性范围、临床可报告范围、参考区间验证、稳定性测试6个方面对Shine i2900 全自动化学发光免疫分析仪检测血栓四项进行了验证，综合结果显示该仪器检测血栓四项的效能均达到厂商宣称指标，可满足临床使用要求。