番茄青枯病拮抗菌株的筛选、鉴定及发酵条件的优化

卢晓虹，许 敏，李甜爽，刘海霞，王美琴

（山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801）

近年来，随着设施番茄种植面积的不断扩大，品 种单一，连作现象严重等问题导致土传性病害发生严重，其中由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的番茄青枯病，严重时造成毁灭性危害。番茄青枯病是设施栽培的重要病害之一，该病可造成番茄植株大面积萎蔫直至死亡，发病较严重的田块发病率可高达80%以上，严重影响番茄的产量，使其产量急剧下降甚至绝收[1-3]。对于番茄青枯病常用的防治方法主要有施用化学药剂、改良土壤结构和性质以及选育抗病品种等，但这些防治方法效果均不稳定[[4-5]，且长期使用化学药剂会导致土壤板结、农药残留、产生抗药性、微生物态体系遭到破坏等不良影响，因此，生物防治成为解决土传性病害最有效、安全的防治方法之一[6-7]，同时也受到人们的广泛关注与研究。利用拮抗菌防治番茄青枯病成为具有应用前景的防治措施之一，如何分离筛选出在室内有较好抑菌效果的菌株并可在田间发挥理想的防治效果，是生物防治面临解决的关键性问题。王丽丽等[4]利用筛选到的拮抗菌株W12和W118进行田间生防效果试验，其防治效果达到43.0%。郑雪芳等[1]采用抑菌圈法筛选出24个对青枯雷尔氏菌具有拮抗作用的菌株，其中，菌株FJAT-20261和FJAT-19700盆栽防效分别达72.73%和67.77%。罗坤等[8]筛选出6株对番茄青枯病有拮抗活性的菌株，其中，1株拮抗菌株室内盆栽防效达96.40%。进一步加强此方面的研究将有效控制青枯病的发生和流行，从而确保拮抗菌株持续稳定的发挥防治效果，特别是具有拮抗效果微生物的生存环境和生态适应能力是决定防治效果的关键所在。利用生防菌防治植物病害，主要是通过其代谢产物及其产生的抗菌活性物质对病菌起到抑制作用[9-10]。微生物在代谢过程中，会受到诸多因素影响，如培养时间、p H、温度、培养基组分等[11]。有益微生物在适宜的环境条件下培养有利于其生长，通过对发酵条件的优化增加拮抗菌株抑菌活性物质的数量，从而提高抑菌效果[12]。发酵优化过程中常采用单因素试验与正交试验相结合的方法[13]，以测量的吸光度值及抑菌圈大小为参考指标[14-16]，对发酵培养基配方及发酵条件进行优化[17-19]。

目前，番茄青枯病生物防治方法大都处于试验阶段，进入实际生产的很少。前人筛选出来的拮抗菌株在室内的盆栽试验当中效果明显，但在田间条件下出现防治效果不太稳定的现象。为了能有效控制番茄青枯病害的发生流行，分离筛选出具有较好抑菌效果的菌株具有重要意义。目前，番茄青枯病生物防治方面缺乏高效稳定的生防菌株。为此，本试验从健康番茄植株根际土壤中筛选出理想的拮抗菌株，并对其生长条件进行优化，旨在为进一步开发出有效防治青枯病的生物菌剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土样 土样采集于太谷县范村镇象谷村健康番茄植株的根际土壤，共采集38份土样。

1.1.2 供试菌株 番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum），由山西农业大学植物保护学院植物病理实验室保存提供。

1.1.3 供试培养基 NA培养基：蔗糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，琼脂粉15 g，1 000 mL蒸馏水，p H值7.0；NA培养基中不加琼脂粉即NB培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄根际土样中微生物的分离 采用稀释涂布分离法，每份土样取10 g，碾碎后加入三角瓶（有玻璃珠）中，再加入90 mL无菌水振荡30 min，静止后依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6g/mL质量浓度梯度的菌悬液，每个梯度取0.1 mL涂布在NA平板上[20]，然后置于30℃的培养箱中，培养24 h后观察，挑取不同形态特征的单菌落纯化后进行编号。

1.2.2 番茄青枯病菌拮抗菌株的筛选 初选：采用对峙培养法，将培养48 h的番茄青枯病菌菌悬液稀释1 000倍后涂布在NA平板上，静止10 min后，将1.2.1分离纯化的147个菌株均匀点接在平板上[20]，每个平板点接4个菌株，在30℃培养24 h后观察，记录有抑菌效果的菌株，每个处理重复3次。

复选：将初选具有拮抗效果的细菌菌株18个分别接种到NB培养液中，置于28℃培养箱中培养48 h制成菌悬液，稀释1 000倍后取0.1 mL均匀涂布在NA平板上，静止20 min后将蘸有番茄青枯病菌发酵液的无菌滤纸小圆片接在平板中央，置于28℃培养箱中培养，观察并记录抑菌圈的大小，每个处理重复3次。

1.2.3 拮抗菌株B-6的鉴定

1.2.3.1 形态鉴定 将1.2.2筛选到的拮抗菌株B-6接种到NA平板上，观察细菌菌落的大小、颜色、边缘形状、隆起形状和透明度及观察在NB液体培养液菌株的培养性状，如有无色素的产生、有无沉淀、有无菌璞和菌膜的产生、有无特殊气味等；通过革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态，通过扫描电镜在电镜下观察菌体的形态、大小等特征。

1.2.3.2 生理生化鉴定 测定生理生化指标的具体试验方法参照文献[21-22]进行。

1.2.3.3 分子生物学鉴定 采用TSINGKE植物DNA提取试剂盒对拮抗菌株B-6的基因组DNA进行提取，且对拮抗菌株B-6的16S rDNA进行PCR扩增反应。16S rDNA PCR扩增反应引物：正向引物为5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物为5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以1×TSE101金牌mix进行扩增；反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min。PCR反应完成后，将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将准备好的PCR扩增产物送至西安擎科测序有限公司进行测序。

1.2.4 拮抗菌株B-6生长曲线的测定及种子培养 将1.2.2筛选出的拮抗菌株B-6菌株活化后，从平板上挑取2环接种于50 mL（250 mL锥形瓶）NB培养基中，于28℃、180 r/min振荡培养，每隔1 h取出1瓶测其吸光度（OD600），重复3次。以OD600为纵坐标、培养时间为横坐标，绘制拮抗菌株B-6的生长曲线[23]。根据生长曲线培养菌种直到生长到对数期后将其接种于发酵培养基中进行后续的试验。

1.2.5 拮抗菌株B-6发酵培养基的优化

1.2.5.1 最佳碳源的筛选 蛋白胨5 g、氯化钠3 g、蒸馏水1 000 mL、p H值调至7.0左右，分装于250 mL的锥形瓶中，每瓶装液量50 mL，制成无碳源基础培养液。将葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉及果糖共5种碳源配制成体积分数为10%的溶液[24]，与无碳源基础培养液分开灭菌。灭菌完毕后，将碳源溶液以1%的量添加到基础培养液中。待冷却后加入1%的拮抗菌株种子液，置于28℃、180 r/min摇床中培养24 h，将发酵液取0.1 mL涂布在NA平板上，平板中央点接番茄青枯病菌进行平板对峙，根据其抑菌圈大小来确定最佳碳源。

1.2.5.2 最佳氮源的筛选 蔗糖10 g、氯化钠3 g、蒸馏水1 000 mL、p H值调至7.0左右，分装于250 mL的锥形瓶中，每瓶装液量50 mL，制成无氮源基础培养液。将蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、氯化铵及硫酸铵共5种氮源配制成体积分数为5%的溶液[24]，与无氮源基础发酵培养液分开灭菌。灭菌完毕后，将氮源溶液以0.5%的量添加到基础培养液中。方法同1.2.5.1，根据其抑菌圈大小选出最佳氮源。

1.2.5.3 最佳无机盐的筛选 蔗糖10 g、蛋白胨5 g、蒸馏水1 000 mL，p H值调至7.0左右，分装于250 mL的锥形瓶中，每瓶装液量50 mL，制成不含无机盐的基础培养液。将氯化钠、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸亚铁及氯化钾共5种无机盐配制成体积分数为3%的溶液[24]，与不含无机盐的基础培养液分开灭菌。灭菌完毕后，将无机盐溶液以0.3%的量添加到基础培养液中。方法同1.2.5.1，根据其抑菌圈大小选出最佳无机盐。

1.2.5.4 正交试验 发酵培养基各因素间最佳配比组合：以抑菌圈直径的大小为衡量指标，对发酵培养基中的碳源体积分数（A）、氮源体积分数（B）、无机盐体积分数（C）进行优化。每个影响因素设置3个水平，组成3因素3水平正交试验。各因素水平如表1所示，之后按SPSS正交试验设计出的各因素水平的组合方案进行试验，每个处理重复3次。将NB培养基分装50 mL于规格为250 mL锥形瓶中，接种1%的菌株种子液，后置于28℃、180 r/min的恒温摇床中培养24 h，通过对峙试验测量其抑菌圈直径大小。对测量结果进行极差分析和方差分析，确定各因素各水平间的最佳组合。

表1 发酵培养基因素水平Tab.1 Fermentation medium factor level %

1.2.6 拮抗菌株B-6发酵条件的优化 以确定的最佳发酵培养基为基础，选出对发酵效果影响较大的发酵时间（D）、装液量（E）、接种量（F）及pH（G）4个因素进行优化试验。每个因素设置3个水平，组成4因素3水平试验（表2），使用SPSS进行正交试验设计，确定组合方式进行试验。各处理分别置于相应的培养条件下进行发酵培养，24 h后与番茄青枯病原菌进行平板对峙测量其抑菌圈直径大小，3次重复。对测量结果进行极差分析和方差分析，经综合分析确定最佳发酵条件。

表2 发酵条件因素水平Tab.2 Fermentation condition factor level

1.3 数据处理

试验采用Excel 2019进行图表的制作；采用SPSS 21.0进行数据处理、极差分析及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 番茄青枯病菌拮抗菌株分离与筛选

从38份土样中共分离筛选出147株平板菌落形态特征不同的菌株，初筛结果分离筛选出18株有抑菌效果的拮抗菌株，经纯化和复筛，其中，拮抗菌株B-6与B-17菌株抑菌效果最好，且比较稳定，B-6抑菌圈直径达到13.8 mm，B-17抑菌圈直径达到12.3 mm，其拮抗菌株的平板抑菌效果如图1所示。

2.2 拮抗菌株B-6培养性状及菌体形态

从图2可以看出，拮抗菌株B-6在平板上的单菌落为不规则圆形，呈淡黄色，不透明，微隆起，略有光泽度，边缘不整齐，有刺激性气味产生；拮抗菌株B-6在培养液中培养，逐渐变浑浊，3 d后，试管内出现乳白色沉淀，5 d后在液体表面长出了白色菌璞，在培养液中出现片状菌膜（图3）。

拮抗菌株B-6经革兰氏染色镜检可知G+，菌体短杆状，无荚膜，无鞭毛（图4）；通过电镜观察可知，拮抗菌株B-6细胞为短杆状，菌体大小约为（1.5～2.7）μm×（0.5～1.2）μm，不具有鞭毛，单个或2～4个细胞形成短链（图5）。

2.3 拮抗菌株B-6的生理生化特性

对拮抗菌株B-6各项生理生化指标进行鉴定，结果表明（表3），该菌株在20～37℃可以生长，4℃以下和41℃以上停止生长；耐盐性与需盐性试验表明，该菌株可以在含有2%～7%的NaCl培养液中生长；荧光色素中菌株培养1、3、5 d后在紫外灯下观察均有荧光；丙二酸与柠檬酸盐试验中呈阳性。葡萄糖氧化发酵中经观察发现，2种指示培养基均产酸变黄，为发酵型；接触酶和甲基红试验呈阳性；糖类发酵试验指示剂没有变色呈阴性；淀粉水解反应呈阳性；V-P测定试验呈阴性；硝酸盐还原测定试验为硝酸盐还原阳性。

表3 拮抗菌株B-6的生理生化鉴定结果Tab.3 Physiological and biochemical identification result of the strain B-6

2.4 拮抗菌株B-6的分子生物学鉴定

通过提取拮抗菌株B-6的基因组DNA并进行PCR扩增，得到1条长约1 500 bp的DNA片段，经扩增产物测序后得到长度为1 424 bp的16S rDNA序列，将上述16S rDNA与NCBI数据库中已注册的16S rDNA序列进行同源相似性比较，同时构建系统发育树（图6）。对比结果表明，拮抗菌株B-6与假单胞菌的遗传距离最近，且它与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）处于同一分支上，拮抗菌株B-6 16S序列比对结果为Pseudomonasaeruginosastrain Pa84（或同属）。综合拮抗菌株B-6的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。

2.5 拮抗菌株B-6的生长曲线绘制

由图7可知，拮抗菌株B-6生长曲线分布：0～7 h为延迟期，8～22 h为对数生长期，23～25 h为稳定期，25 h后细菌生长进入衰亡期。在菌株的对数生长期内，菌株生长迅速，代谢旺盛，适合作种子液。因此，最终确定拮抗菌株B-6发酵用种子液培养时间为22 h。

2.6 拮抗菌株B-6发酵培养基配方的优化

通过比较不同培养基发酵所得到的发酵培养液的抑菌效果发现，当发酵培养基的碳源为麦芽糖时，抑菌效果最佳，抑菌圈直径可达到（15.80±0.30）mm。通过比较加入不同氮源发酵得到的发酵培养液的抑菌效果发现，当发酵培养基氮源为蛋白胨时，抑菌效果最佳，抑菌圈直径可达到（16.20±0.20）mm。通过试验添加5种不同的无机盐所得到的发酵培养液测定的抑菌效果发现，当发酵培养基无机盐为氯化钠时，抑菌效果最佳，抑菌圈直径可达到（13.40±0.25）mm（表4）。

表4 拮抗菌株B-6发酵培养基配方的优化Tab.4 Optimization of fermentation medium formulation of antagonistic strain B-6 mm

2.7 正交试验结果

2.7.1 拮抗菌株B-6发酵培养基配方正交优化结果 在确定拮抗菌株B-6合适的发酵培养液各组分种类的基础上，进行正交优化试验。从表5可以看出，3个因素的极差（R）值存在差异，各因素对拮抗菌株B-6生长量的影响大小通过R值反映，R值越大则表明该因素对菌株的影响效果越大，反之则越小。

表5 拮抗菌株B-6发酵培养基最佳组合的正交试验结果及极差分析Tab.5 Orthogonal test results and range analysis of the optimal combination of fermentation medium of antagonistic strain B-6

由表5可知，RC＞RA＞RB，即无机盐＞碳源＞氮源，无机盐对菌株的拮抗活性抑菌效果影响最大，其次依次为碳源和氮源，A 3B2C2组合所产生的抑菌圈直径为16.5 mm，与采用基础发酵培养基培养所得发酵液对峙产生的抑菌圈直径13.8 mm相比，发酵优化后抑菌圈直径增加了19.6%，差异较明显。方差分析和显著性检验如表6所示，碳源、氮源及无机盐的P值均大于0.05，表明3种因素差异均不显著，但从表5可以看出，这3种发酵配方因素变化对拮抗菌株B-6拮抗活性物质的生物量影响差异从大到小依次为无机盐＞碳源＞氮源，即无机盐变化对其影响较大，氮源变化对其影响较小。经综合极差分析和方差分析结果，最终确定拮抗菌株B-6最佳发酵培养基组合为A 3B2C2，即麦芽糖3%（30 g）、蛋白胨1.0%（10 g）、氯化钠1.0%（10 g），蒸馏水1 000 mL。

表6 拮抗菌株B-6发酵培养基最佳组合的方差分析Tab.6 Analysis of variance of the optimal combination of fermentation medium of antagonistic str ain B-6

2.7.2 拮抗菌株B-6发酵条件正交优化结果 拮抗菌株B-6最佳发酵条件正交试验及结果分析如表7所示，4个因素极差有差异，对于拮抗菌株B-6产生拮抗物质生物量大小的影响通过R值大小反映，R值越大，则表明该因素对菌株的影响效果越大，反之则越小。由表7可知，RD＞RG＞RE＞RF，即发酵条件对拮抗菌株B-6拮抗活性的影响依次为发酵时间＞pH＞装液量＞接种量，说明发酵时间对拮抗菌株B-6的拮抗活性物质的生物量影响最大，其次依次为p H、装液量及接种量。通过方差分析和显著性检验发现（表8），发酵时间、装液量、接种量及p H的P值均大于0.05，表明4种因素差异均不显著。但从表7可以看出，影响拮抗菌株B-6产生抗菌活性物质数量的4种发酵条件因素其差异大小依次为pH＞装液量＞发酵时间＞接种量，即pH值变化对其影响较大，接种量变化对其影响较小。经综合极差分析和方差分析结果，最终确定拮抗菌株B-6的最佳发酵条件组合为D1E3F1G3，即发酵时间24 h、装液量100 mL（规格为250 mL锥形瓶）、接种量1.0%（1 mL），p H值8。

表7 拮抗菌株B-6发酵条件的正交试验结果及极差分析Tab.7 Orthogonal test results and range analysis of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

表8 拮抗菌株B-6发酵条件正交试验结果方差分析Tab.8 Variance analysis of orthogonal test results of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

续表7 拮抗菌株B-6发酵条件的正交试验结果及极差分析Tab.7（Continued） Orthogonal test results and range analysis of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

3 结论与讨论

生物防治是控制番茄青枯病有效的途径，主要是利用分离筛选到的拮抗菌株对其进行防控。目前，国内许多学者从植株根际土壤中分离筛选具有拮抗作用的生防细菌。毕凯丽等[25]从土壤中筛选对水稻胡麻斑病病原菌（Helminthospotium oryzaeBreda de Hann）具有稳定拮抗作用的细菌。王丽丽等[6]从番茄青枯病重病田块的健康植株根际土壤中分离筛选得到2株高效拮抗菌株，经16S rDNA鉴定均为芽胞杆菌属。郑雪芳等[1]采用抑菌圈法从不同地理来源的植物根际土壤中筛选出24个对青枯雷尔氏菌具有拮抗作用的芽孢杆菌。

本研究利用稀释涂布分离筛选到1株对番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）抑菌效果最好的拮抗菌株B-6，经过鉴定确定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），并对其发酵液配方及发酵条件进行了优化，使其发酵液抑菌效果最强。结果表明，健康植株的根际土壤中含有拮抗菌株，可以用来防治植物病原菌，有望成为生物防治病害又一主力军。但筛选出的拮抗菌株如何在大田土壤中能有效定殖且发挥高效稳定的防治效果，有待进一步研究。

利用拮抗菌株进行生物防治过程中，如何使其产生较多抗菌物质及提高抑菌效果对防治植物病害十分重要。拮抗菌株发酵液除了受到发酵培养基各组分影响外，还会受到培养条件的制约，通过对发酵液配方及发酵条件的优化，拮抗菌株抑菌物质数量显著提高，从而充分发挥其抑菌作用[26-27]。目前对生防菌发酵条件优化的研究，一般采用单因素结合正交试验的方法[28]。正交试验设计是研究多因素多水平的一种设计方法，具有高效和快速的特点。菌体发酵是一个较复杂过程，受到很多因素的影响。本试验根据单因素试验的结果进行正交设计优化，优化了发酵培养基各组分及最佳发酵条件，拮抗菌株B-6最佳发酵培养基为麦芽糖3%（30 g）、蛋白胨1.0%（10 g）、氯化钠1.0%（10 g），蒸馏水1 000 mL，最佳发酵条件为发酵时间24 h、装液量100 mL（规格为250 mL锥形瓶）、接种量1.0%（1 mL），p H值为8。拮抗菌株发酵条件优化以对峙抑菌圈大小作为衡量指标，前人已有许多的报道[29-32]。杨晓楠等[13]采用正交试验设计确定了黄瓜菌核病拮抗菌株T 111的最佳发酵培养基组合和发酵条件，优化后其抑菌效果增加了69.4%；刘晓琳等[17]通过采用单因素试验与正交试验方法筛选出对枣果黑斑病有抑菌效果的拮抗菌xj063-1菌株的最佳发酵培养基配方和发酵条件；侯敏等[29]在单因素试验的基础上，采用正交试验研究了培养基各组分对拮抗细菌S13产生芽孢的影响。

本研究仅是在恒温摇床条件下对拮抗菌株B-6发酵培养基配方及发酵条件进行优化，为今后拮抗菌株B-6生物菌剂的研发和研究进展提供了一定的理论依据，但没有将其投入到盆栽及大田防效试验中检测其防治效果。由于发酵是一个较复杂的过程，试验中仍存在许多不足之处，需进一步的调整与完善，为了使其能够产业化，还需进一步对其代谢过程进行研究。目前，该菌株已保存在中国微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No.24048，正在申报国家发明专利，已被国家专利局受理。