基于高基元SSR构建黍子DNA分子身份证

丁艺冰，丁雨格，陈 凌，王海岗，陈喜明，王瑞云，，乔治军

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 玉米研究所，山西 忻州 034099；3.山西农业大学农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西太原 030031）

在植物学分类中，黍（Panicum miliaceumL.）属于禾本科黍属的单子叶植物、1年生草本植物，亦称糜子，是起源于我国最古老的农作物之一，具有生育期短、耐旱、耐贫瘠等特点，是抗灾备荒、复种增收、调节农业种植结构的先锋作物[1]。黍子抗逆、抗旱，且对环境、耕地要求不高，适应性广，是旱作地区最主要的粮食生产种类之一[2]，比其他作物更容易在高原高海拔或者其他不良环境中生存下来，常常作为比较稳产的粮食作物，在干旱地区种植也常常因其作物特点作为其他作物失败或者种植延迟时的补救作物，避免造成粮食短缺对其进行深入研究，对于我国干旱地区的农业发展具有重要的价值[3-7]。

黍子脱壳后为黄米，可酿酒、制糕、煮粥，黄米含有丰富的营养成分，富含人体稀缺的维生素B族、铜、锌、锰等，有调理脾胃、明目安神、益阴利肺、预防糖尿病和心血管病的功效[8]。黍子营养价值和药用价值均有很高的水平，黍子所含的蛋白质、脂肪、膳食纤维、灰粉等主要营养成分含量比大米高[9]，维生素B1、B2以及β-胡萝卜素略高于大米，富含锰、镁、钠、钙、铜、铁、锌等微量元素；蛋白质以清蛋白、谷蛋白、球蛋白为主，氨基酸含量丰富，超出玉米、小麦、水稻的氨基酸含量[10]。黍子粳性品种的各个生长阶段的直链淀粉积累量均高于糯性品种，对开发黍子食品具有重要意义[11]。从黄土高原的峡谷沟壑到内蒙古高原的丘陵山地，均有黍子种植，其拥有非常发达的根系，能从深层的土壤中吸收水分，茎秆叶片上的绒毛和蜡质层能减少自身水分的蒸发，这样能充分利用有限的水热资源，躲过旱季，在很短时间内完成一生并获得一定的产量[12]。相关研究表明，我国栽培黍的伴生杂草种群会导致驯化黍的种群变异，且佐证了野生以及驯化的黍子种群结构模式存在至少有2个独立驯化区的假设[13]。关于黍子的起源地，相关研究表明[14]，我国的华北夏糜子区、黄土高原春夏糜子区、东北春糜子区的糜子遗传相关性较大，遗传关系也较为复杂，这为阐明我国是黍子作物的起源中心提供了有力证据。

随着各种分子标记技术的发展，育种家加强了对新品种的保护意识，促进了作物DNA指纹图谱研究的发展，但早期的指纹图谱大都是基于少数品种和有限标记识别位点，其应用的广度非常有限，而且指纹图谱鉴定在于对比图片中的众多差异，不易快速区分不同品种。近几年，分子身份证的概念应运而生，其与指纹图谱的功能相同，但分子身份证原则上是以广泛基因组覆盖度的最少共显性特异变异位点或标记为基础，提取每份种质有代表性、稳定和特异的遗传信息，并通过数字化处理和软件分析建立分辨不同种质的字符串形式，以达到简单明了区分品种间差异、在广度上更直观地进行品种检索的目的，并能更有效利用。

简单序列重复（Simple Sequence Repeat，SSR）分子标记技术，是一种基于DNA长度多态性的分子标记技术，具有丰富的多态性，且重复性优良，被广泛应用于对群体进行遗传结构的分析和遗传图谱的构建[15]。其在基因定位[16]、检测种子纯度[17]、品种鉴定[18]、研究亲缘关系的远近[19]等方面已有广泛的应用。

近年来，SSR分子标记技术的快速发展，为我国的现代分子技术作出了巨大贡献。许多不同品种农作物的真实性和纯度也通过SSR分子标记得到 鉴 定，例 如 大 麦（Hordeum vulgareL.）[20]、甘 蔗（Saccharum officinarum）[21]、南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）[22]、芥菜（Brassica juncea）[23]、亚麻（Linum usitatissimumL.）[24]、李 子（Prunus salicina）[25]、棉 花（Gossypium hirsutum）[26]等。何 杰 丽 等[27]用80个SSR评估144份种质，基于聚类分析（UPGMA）将资源划分为3个。现有的黍子DNA分子水平的研究不够成熟，且部分研究供试种质材料范围及数量均较小，该问题更明显；而对于黍子这样一个种质数量大、体系繁杂的类群来说，基于黍子SSR构建DNA的分子身份证构建研究尚未见报道[28-29]。

当前，由于世界经济全球化的发展，人民生活水平不断提高，国与国之间的交流日渐频繁，综合国力的竞争越来越激烈，粮食生产已成为提高一个国家综合国力的重要环节，提高粮食作物生产产量也是提高国际竞争力的途径之一。随着农业产业的迅速发展，农作物新品种也在日益发展，农作物新品种的必备特征是特异性、一致性和稳定性，诞生过程中会出现某些形态特征相似、血缘关系相近、适应环境能力相同的情况，一般的鉴定性状指标大多是存在连续变异、易受环境影响的数量性状，很难做出明确描述。

艾呈祥等[30]利用10对SSR引物对38份甜樱桃种质进行扩增，将分子指纹赋值后构建了其分子身份证。高运来等[31]利用9对SSR引物构建了83份黑龙江部分大豆品种的分子身份证。地方品种、农家种、育成品种和野生资源中异物同名和同物异名现象大量存在，严重影响着资源的高效利用。关于作物品种的认定工作既繁琐而且花费时间较长，市场流通的品种鱼龙混杂，农家品种流通不够或者是无法发挥品种的最大价值，造成种质资源严重浪费，创建准确可靠而且操作便捷的资源鉴定系统势在必行，需为黍子品种制定一份专属的DNA分子身份证，以便更好地开发和利用黍子种质资源。

本研究选取华北平原、黄土高原、东北平原等不同地理区域的20份黍子材料，利用30对高基元SSR引物构建20份资源的分子身份证，旨在为黍子资源的高效系统管理和合理应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为来自于华北平原、黄土高原、东北平原等不同地理区域的20份黍子（表1），选取各份材料的适量种子在适宜的人工条件下播种，待各份材料的幼苗长至三叶期时，取叶片约0.3 g，液氮保存至-80℃冰箱备用。

表1 20份黍子试验材料明细Tab.1 The detail of 20 accessions of Panicum miliaceum in this exper iment

1.2 黍子基因组DNA的提取及PCR扩增

剪取三叶期黍子叶片，采用改良CTAB法[32]提取基因组DNA。DNA的完整性及浓度检测方法参见文献[27]进行。利用35对高基元引物[33]（表2）对来自我国不同地理区划的20份黍子材料进行扩增，选取扩增结果稳定、多态性高、条带完整清晰的引物构建黍子DNA身份证。

PCR扩增反应体系如表3所示。轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应。反应程序为：94℃4 min；94℃40 s，不同Tm（表2）退火40 s，72℃1 min，36个循环；72℃8 min[34]。反应完成后，取3μL产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

表2 SSR引物及退火温度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

表3 PCR扩增反应体系Tab.3 Reaction system of PCR amplification

1.3 数据统计与分析

取出染色好的凝胶，将其平铺在LED灯胶片观片台上读取凝胶电泳结果，在凝胶同一位置，有扩增条带的记为1，无扩增条带的记为0；而后通过软件Pop Gen 1.32（Yeh and Boyle，1997）、MEGA 5.0（Tamura et al.,2011）、PowerMarker 3.25（Liu and Muse，2005）计算SSR遗传多样性参数。品种分子身份证由东北农业大学研发的资源特征分析软件ID Analysis 4.0建立。对应字符串通过在线条形码生成（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php），生成可扫描的条形码用作DNA分子身份证；黍子材料的基本信息和DNA分子身份证代码等相关文字信息通过二维码在线技术（http://cli.im）生成二维码DNA分子身份证。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

选取的材料是来自于华北平原、黄土高原、东北平原等不同地理区域的20份黍子材料，用35对SSR引物进行扩增，结果发现，30对引物（RYW1、RYW2、RYW3、RYW4、RYW5、RYW6、RYW7、RYW8、RYW9、RYW10、RYW11、RYW12、RYW13、RYW14、RYW15、RYW16、RYW17、RYW18、RYW19、RYW20、RYW21、RYW22、RYW23、RYW24、RYW25、RYW27、RYW29、RYW33、RYW34、RYW35）可扩增出条带清晰、稳定多态性较高的引物，其可作为候选核心引物用于分子身份证的构建。其中，RYW5引物对20份黍子材料的聚丙烯凝胶电泳结果如图1所示。

2.2 引物多态性及遗传参数分析

用30对SSR引物对20份黍子资源实行扩增，得到表4中10对引物用于构建分子身份证。

表4 10对SSR引物的遗传多样性参数Tab.4 Genetic parameters of 10 pairs of SSR markers

由表4可知，20份材料在30个位点共检测出30个观测等位变异，每一个位点都检测到3个等位基因（平均3个）；有效等位变异为2.168 2（RYW7）～2.985 1（RYW35）个，平均为2.636 7个；Shannon多样性指数为0.899 7（RYW7）～1.096 1（RYW35）,平均为1.020 6；观测杂合度为0.473 7（RYW7）～0.833 3（RYW3），平均为0.677 7；期望观测杂合度为0.553 3（RYW7）～0.677 1（RYW1），平均为0.635 0；Nei's基因多样性指数为0.538 8（RYW7）～0.665 0（RYW35），平均为0.617 3；多态性信息含量为0.526 2（RYW3）～0.749 3（RYW1），平均为0.657 9；根据BOTSTEIN[35]提出的理论，10对引物都具备高度多态性（＞0.5），可用于分子身份证的构建，其余20对引物多态性较低，不可用于分子身份证的构建。

2.3 黍子种质的分子ID构建

将全部黍子的供试材料利用5对引物（RYW8、RYW12、RYW5、RYW2、RYW1）组合构建字符串DNA分子身份证，结果如表5所示。例如供试材料1的分子身份证为01111，代表该引物次序下的供试材料1在引物RYW8扩增产物电泳后同一凝胶位置中表现为无条带、而引物RYW12、RYW5、RYW2、RYW1的扩增产物表现为有条带，即为供试黍子材料1的DNA分子身份证。以此类推，可得到20份供试黍子材料的DNA分子字符串。

表5 20份黍子资源的分子身份证编码Tab.5 Code of molecular ID of 20 Panicum miliaceum resources

将试验获得的各黍子供试材料字符串DNA分子身份证在在线条形码生成器中输入，获得DNA分子身份证的条形码（图2）；将各黍子供试材料的基本信息如名称、统一编号、生态区、来源、字符串DNA身份证号、备注等在在线二维码生成器中输入，得到DNA分子身份证二维码（图3）。

3 结论与讨论

近年来，对黍子的遗传多样性分子标记非常有限，尤其是多态性高、检测能力强的SSR标记更少[36]。利用SSR分子标记，可从分子水平上探究物种遗传的多样性，加上群体遗传特点，可探讨品种内及其近缘种属之间的起源、变异及进化[11]。构建的核心种质资源被要求用最少的数目来最大范围地包含供试植物资源的遗传多样性。查阅已有研究文献，得到黍子基因多样性指数分别为0.859 9[27]、0.628 4[27]、0.841 5[37]、0.768 6[38]、0.736 0[39]、0.847 8[40]，多态性信息含量分别为0.457 3[27]、0.587 4[41]、0.427 9[37]、0.566 7[38]、0.471 4[39]、0.554 4[40]；而本试验检测到这2个指标分别为1.020 6和0.657 9，均高于已有研究结果，可能与研究材料及样本数量差异有关。在2017年，王瑞云等[27]用85个高基元SSR检测到96份黍子资源的基因多样性指数和多态性信息含量分别为0.770 8和0.472 3，均低于本研究，这可能与本研究的20份供试材料有关。

目前，SSR标记的检测方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光毛细管电泳法2种。杨文娟等[42]用这2种方法检测芝麻应用核心种质发现，对于多态性条带较少、条带间分子量差异大和扩增带型清晰的标记，聚丙烯酰胺凝胶电泳法和荧光毛细管电泳法的电泳结果基本一致。聚丙烯酰胺凝胶电泳法无需昂贵的试验器材，试剂费用低；而荧光引物仅能保存1～2 a（常规引物则为3～5 a），且荧光毛细管电泳法的合成成本远高于聚丙烯酰胺凝胶电泳法。限于经济条件，加之试验材料数量少，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法构建黍子的DNA分子身份证可行。

DNA分子身份证是基于DNA指纹图谱，运用多种编码数字化处理电泳图谱获得字符串，并辅以条形码/二维码等科学表述，在资源鉴定方面应用广泛[43-44]。用SSR构建资源分子身份证有3种编码方法：第1种为0/1代码类型，根据电泳条带有无赋值1/0形成0/1字符串；第2种为等位基因赋值编码类型，编码扩增等位基因；第3种为基因型赋值编码类型，编码扩增带型[45]。本研究采用第1种方法编码，统计方便、书写简洁，字符串长度适中，易于检索。

以往研究多使用低基元SSR构建作物资源的分子身份证。颜静宛等[40]利用24对SSR引物对121份水稻常规品种和16个杂交水稻品种进行了多态性信息含量分析，其平均为0.520 0；李红琴等[46]用212对SSR引物辨别了66份小麦供试材料，多态性信息含量平均为0.510 0。而本试验对20份来源于华北平原、黄土高原、东北平原的黍子材料用30对高基元SSR引物进行扩增，多态性信息含量为0.657 9，高于已有低基元SSR引物研究结果。随着新品种研发的不断深入和新种质资源的认定完成，以往的作物数据库存在一定的局限性，之后应不断完善、扩充数据库的规模及增加核心引物构建的组合数量；同时，分子身份证的构建不仅需要包含其遗传学信息，还需要包含该作物的社会属性，只有这样才能准确描述一个品种，为作物品种的研究与鉴定提供参考依据，实现资源管理的科学化和规范化。