新鲜枸杞叶中黄酮提取工艺的优化及抗氧化性分析

缪文玉，李冠文，殷孝莹，秦 楠

（1.太原城市职业技术学院 管理工程系，山西 太原 030027；2.山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西 晋中 030619）

宁夏枸杞是中国药典中最好的唯一药用品种，其根、叶、花、果实均可入药。枸杞叶（Lycium barbarumleaves）是茄科枸杞属植物枸杞（LyciumbarbarumL.）的嫩叶，其性味苦、甘、涩，具有补肾益精、清热明目、延缓衰老等功效[1]。现代研究表明，枸杞叶药理作用复杂多样，主要有抗衰老[2]、降血糖、降血脂[3-4]、抗炎镇痛、抑菌、抗氧化[5-6]等作用且从枸杞叶化学成分来看，其所含活性成分有生物碱、黄酮、多糖、酚类、蛋白质、脂肪、氨基酸、微量元素以及萜类化合物等，其中，以多糖类以及黄酮类化合物的含量较高，因而现代学者对枸杞叶中这2种化合物的研究较为广泛。崔今[7]通过高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS法）对枸杞叶干药材提取物进行鉴定，研究表明，枸杞叶提取物是由11种黄酮类化合物组成，且药理作用研究发现黄酮提取物可以达到显著的降血糖效果。范艳丽等[8]的研究结果证实了枸杞叶干药材黄酮提取物对超氧阴离子、·OH、DPPH、亚硝基以及ABTS自由基具有显著的清除能力，因而得出黄酮提取物是天然的氧化剂的初步结论。吕海英等[9]研究发现，黑果枸杞叶中的黄酮类化合物具有显著的抗衰老、降血脂作用，推测可能与其中的芦丁、槲皮素、木犀草素、异鼠李素及山奈素成分的含量息息相关。干药材枸杞叶中富含较多活性成分且具有丰富的药理作用，为本试验研究新鲜枸杞叶活性成分及抗氧化活性奠定了坚实了理论基础。

枸杞叶黄酮类成分的提取以往大多采用有机溶剂提取法，该法存在有机溶剂消耗量大、回流时间长等缺点，而近几年新兴起的超声波辅助酶解提取法具有耗时短、酶解速度快、操作简便等特点，因此，本试验选用该提取法进行研究。目前，国内外对中药材枸杞属枸杞的化学成分、药理作用等研究主要集中在不同品种枸杞子以及黑果枸杞叶等，对宁夏枸杞叶研究多为干燥枸杞叶而对新鲜宁夏枸杞叶没有相关研究。新鲜枸杞叶廉价易得、无任何前处理操作，可有效减少有效成分的损失。因此，本试验以新鲜宁夏枸杞叶为原材料，利用超声波辅助酶解法手段提取枸杞叶中总黄酮，并通过BoXbenhnken设计分析得到最佳提取工艺参数，在此基础上初步探讨新鲜枸杞叶黄酮提取液的抗氧化活性，旨在为新鲜枸杞叶的综合利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料及试剂

新鲜枸杞叶采摘于宁夏枸杞种植基地。芦丁标准品（≥98%）（上海融禾医药科技发展有限公司）；纤维素酶（郑州宇控生物科技有限公司）；无水乙醇（AR）、硫酸亚铁（AR）、水杨酸（AR）、过硫酸钾（AR）、30%过氧化氢（天津市天力化学试剂有限公司）；硝酸铝（AR）、亚硝酸钠（AR）（山东西亚化学工业有限公司）；氢氧化钠（天津市东丽区南孙庄村西工业区）；Vc、·OH、DPPH、ABTS（纯度均＞99%）（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 超声波辅助酶解法提取黄酮化合物 将新鲜枸杞叶洗净、干燥、粉碎，精密称取约1.0 g枸杞叶粉末，加入16 mg纤维素酶混合均匀，加入30 mL 60%乙醇溶液后调节pH值至5.0，置于40℃水浴锅中酶解30 min，然后将其转移至超声波清洗机中于超声温度50℃、超声功率500 W条件下超声提取30 min，抽滤。所得滤饼按照上述操作再次提取后合并2次滤液，最后定容至1 000 mL容量瓶中备用（图1）。

1.2.2 超声波辅助酶解法的单因素试验

1.2.2.1 超声温度对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响 按照1.2.1步骤操作，固定料液比1∶20、乙醇体积分数60%、超声功率500 W，考察不同超声温度（30、40、50、60、70℃）提取条件下对枸杞叶总黄酮提取率的影响。

1.2.2.2 超声功率对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响 按照1.2.1步骤操作，固定超声温度50℃、料液比1∶20、乙醇体积分数60%，考察不同超声功率（100、200、300、400、500 W）提取条件下对枸杞叶总黄酮提取率的影响。

1.2.2.3 乙醇体积分数对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响 按照1.2.1步骤操作，固定超声温度50℃、料液比1∶20、超声功率500 W，考察不同乙醇体积分数（55%、60%、65%、70%、75%）提取条件下对枸杞叶总黄酮提取率的影响。

1.2.2.4 料液比对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响 按照1.2.1的步骤操作，固定超声温度50℃、乙醇体积分数60%、超声功率500 W，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）提取条件下对枸杞叶总黄酮提取率的影响。

1.2.3 响应曲面设计 按照Box-benhnken中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，以考察新鲜枸杞叶中黄酮提取率（Y）为最终目的，选定超声温度（A）、超声功率（B）、乙醇体积分数（C）、料液比（D）共4个因素进行4因素3水平共27个试验点的响应曲面设计，各因素水平如表1所示。

表1 响应曲面试验设计的因素与水平Tab.1 Design factors and level s of response surface test

1.2.4 芦丁标准曲线的制作及黄酮提取率的计算 参照丁建海等[10]的芦丁标准曲线建立方法，在400～600 nm波长下确定黄酮化合物的最大吸收波长，在最大吸收波长下绘制芦丁标准曲线。准确量取新鲜枸杞叶黄酮提取液1 mL，按照芦丁标准曲线操作方法测定吸光度A值，计算黄酮提取率。

式中，W表示新鲜枸杞叶中黄酮提取率（%）；C表示新鲜枸杞叶黄酮提取液的质量浓度（mg/mL）；V1表示新鲜枸杞叶黄酮提取液的体积（mL）；V2表示稀释倍数；m表示药材取样量（mg）。

1.2.5 黄酮提取液的抗氧化性研究 按上述最佳制备工艺所得的黄酮提取液浓缩至恒质量，称取5 mg放于烧杯中，用适量65%乙醇溶解后转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度线即可得到5 mg/mL的样品溶液。取3 mL该样品溶液于4个不同容量瓶中用65%乙醇分别稀释至15.0、7.5、5.0、3.75 mL，即可得到质量浓度分别为1、2、3、4 mg/mL的样品溶液。将上述5个不同质量浓度样品溶液采用段亚云等[11]的方法进行DPPH自由基的清除活性测定；采用郑朝华等[12]的方法进行OH自由基的清除活性测定；采用何兰香等[13]的方法进行ABTS自由基的清除活性测定。

1.3 数据处理

本试验数据采用SPSS 22.0和Design-Expert V 8.0.6统计软件分析，应用最小差异显著法（LSD）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

试验结果（图2）显示，新鲜枸杞叶黄酮提取液的适宜检测波长为510 nm，且当芦丁质量浓度在0～0.6 mg/mL时，浓度（X）与吸光度值（Y）的线性相关程度最好，线性方程为y=14.684x+0.028 1（R2=0.990 1），R2接近于1，表明在此区间y与x表现出较好的等比增长关系，适宜用此方程式进行后续样品浓度的换算。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 超声温度对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响 由图3可知，超声温度的升高造成黄酮类化合物提取率呈现出急速上升后缓慢下降的现象，超声温度50℃时所对应的黄酮提取率最高（4.5%）。高于50℃后提取率下降，推测可能是因为超声温度可以将枸杞叶细胞破碎增强空化作用，加速化学成分的溶出；当超声温度高于一定程度后，由于高温导致空化作用减弱阻碍了黄酮化学成分的溶出[14]。因此，选择超声温度50℃进入后续试验。

2.2.2 料液比对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响料液比对化学成分的溶出具有重要作用，由图4可知，新鲜枸杞叶中黄酮提取率随着料液比的增大表现为先上升后逐渐下降趋势，在料液比为1∶25时，黄酮提取率达到最高（3.7%），而此料液比后提取率下降的原因可能是由于原材料用量固定的情况下溶剂用量倍增造成新鲜枸杞叶中黄酮类化合物溶出率达到饱和，而其易溶于乙醇化学成分的逐步溶出影响了黄酮的分离[15]。因此，选择料液比1∶25进入后续试验。

2.2.3 乙醇体积分数对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响 由图5可知，不同体积分数的乙醇对醇溶性物质的溶出影响程度不同。新鲜枸杞叶黄酮提取率随着乙醇体积分数的升高表现出先上升后下降的趋势，并于体积分数65%乙醇下达到最高（3.8%），此后提取率均低于此值。预测造成黄酮提取率下降的原因是乙醇体积分数过高导致更多脂溶性物质析出从而降低了目标物的溶出率[16-17]。因此，选用65%乙醇进入后续试验。

2.2.4 超声功率对新鲜枸杞叶黄酮提取率的影响 从图6可以看出，超声功率对黄酮类化合物提取率的影响程度较小，功率小于300 W时黄酮提取率趋于平稳；当功率达到300～400 W时黄酮类化合物提取率有效升高最终达到临界值（3.3%）；超声功率大于400 W后新鲜枸杞叶黄酮提取率骤然下降，其原因可能是由于功率在100～300 W时枸杞叶细胞内黄酮受热效应影响而加速溶解，当功率高于400 W时，温度随之升高造成乙醇部分挥发影响了总黄酮的溶出[18]。因此，选用超声功率400 W进入后续试验。

2.3 提取工艺的优化

2.3.1 响应曲面分析及优化 超声温度（A）、超声功率（B）、乙醇体积分数（C）、料液比（D）对黄酮提取率（Y）影响的具体数据进行多元二次回归，得到回归模型方程：Y=5.59+0.35A－0.47B+0.68C+0.098D－0.41AB+0.48AC－0.16AD－0.67BC－1.21BD－0.73CD+0.13A2－0.33B2+0.051C2+0.17D2。

根据表2中P值大小得出，对黄酮提取率的影响因素由大到小依次为C＞B＞A＞D。模型中交互项AB、AC、BC、BD、CD对黄酮提取率均产生显著影响（P＜0.05），且交互项BC、BD、CD达到极显著水平（P＜0.01），其中，失拟误差P值为0.981 0＞0.05，表明多元二次回归模拟方程可以充分说明各因素与提取率之间的函数关系，模型不必再选择更高级别函数。相关系数R2=0.964 8与R2Adj=0.929 7趋近于100%，代表方程模型与试验所得数据契合度较高。模型的P＜0.001，证实模型与试验所得数据拟合效果绝佳，可以用于新鲜枸杞叶中黄酮提取率的理论预测。

表2 模型的方差分析Tab.2 Variance analysis of the model

响应曲面设计建立的曲面模型可以对影响黄酮提取率的单因素以及两因素之间的交互作用作出评价，从而确立最佳水平范围。3D响应曲面图中不同的倾斜度、颜色及整体趋势可以反映出两坐标轴对应的因素之间对响应值即黄酮提取率的影响程度[19]。由图7可知，BC、BD、CD交互作用曲面倾斜度相比其他较高，且曲面颜色可以直观看到呈现加深趋势，而AD交互作用曲面倾斜度一般、颜色无明显变化，说明BC、BD、CD两者之间交互作用较显著，表现为响应值变化趋势剧烈增加。图7所示的各响应面形态各异且顶点都在试验水平范围内，说明黄酮提取率最佳优化条件在试验的水平范围内。

2.3.2 验证试验 考虑到实际操作的可行性，数据分析所得最佳提取工艺（超声温度58.18℃、超声功率320.69 W、料液比1∶28.96、乙醇体积分数67.22%）经调整后修正为60℃、超声功率300 W、料液比1∶30、乙醇体积分数65%，经过试验验证后得到新鲜枸杞叶中黄酮实际提取率为7.742 1%，与理论值（7.706 1%）相差0.036百分点，因此，试验结果表明响应曲面设计所得模型的拟合度较高、产生的误差较小，用模型确定的方程式预测新鲜枸杞叶中黄酮提取率的方法可信度很高。

2.4 黄酮提取液的抗氧化性

2.4.1 新鲜枸杞叶黄酮提取液对DPPH自由基的清除能力 DPPH[20-21]作为具有单一电子、稳定的自由基，在有机溶剂中呈现特殊的紫色反应，而抗氧化剂的出现会导致产生的紫色变浅，从而发生由于强抗氧化性而造成吸光度值减小的现象。从图8可以看出，黄酮提取液质量浓度升高，造成清除率逐渐增大，当质量浓度在3～5 mg/mL时清除率趋于平稳，在5 mg/mL时清除率达86.48%，可以看出，此样液对DPPH自由基具有一定的消除作用，且最终受浓度的影响会变小。

2.4.2 新鲜枸杞叶黄酮提取液对·OH自由基的清除能力 Fe2+、H2O2与水杨酸发生反应所得产物·OH自由基于510 nm波长下有特殊吸收，当样品中存在可与·OH自由基反应的物质时，由于有色化合物产率减少，从而造成吸光度值降低，并可得出样品抗氧化活性增强的结论[22]。从图9可以看出，清除率随着样液质量浓度的升高而逐渐增大，在5 mg/mL时清除率达80.36%，以上结果显示，不同质量浓度的新鲜枸杞叶提取液对·OH自由基有近似呈正相关线性关系的消除作用。

2.4.3 新鲜枸杞叶黄酮提取液对ABTS自由基的清除能力 供试品对ABTS自由基有清除活性的基本思路为：K2S2O8与ABTS反应生成稳定的ABTS+，供试品由于含抗氧化物质可与ABTS+反应得到最终产物，因此，使原溶液褪色造成吸光度值降低[23]。由图10可知，随着新鲜枸杞叶的提取液质量浓度逐步升高，对ABTS自由基的清除能力呈现平稳-轻微下降-迅速上升的趋势。出现轻微下降的原因可能是供试品质量浓度太低导致吸光度数据差距较小，此差距低于仪器检测下限，造成仪器检测是近似认为无显著差异。当达到一定质量浓度后，由于质量浓度差距增大导致吸光度上升。结果显示，黄酮提取液质量浓度在5 mg/mL时清除率可达67.06%，证实该提取液对ABTS自由基有消除效果且与质量浓度高低呈正相关，因此，新鲜枸杞叶黄酮提取液在一定程度上具有抗氧化能力。

3 结论与讨论

超声波可以产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，结合提取溶剂的渗透作用可以达到破坏中药材植物的细胞壁、有效加大溶剂与目标物的接触面积的效果，从而缩短化学成分的溶出时间，提高有效成分的提取率。超声波提取法已经广泛应用于各中药材活性成分的提取方式，为活性成分的溶出提供了有利的后天条件。张鹰等[24]采用超声波提取法得到枸杞叶中黄酮提取率为5.62%，小于本试验新鲜枸杞叶黄酮提取率（7.742 1%），造成此现象的原因可能是本试验采用了超声波辅助酶解方法。

随着酶解法在提取手段上突显出的优势，酶解提取、超声波辅助酶解提取法等新型提取方式随之产生，且极大提高了化学成分的提取率、增强了道地药材的生物利用度。然而由于不同酶的作用不同，产生的效果也不尽相同。陈书明[25]研究发现，不同水解酶对杜仲叶总黄酮的提取率影响效果依次为蛋白酶＞单宁酶＞纤维素酶＞果胶酶。而戢得蓉等[26]等对比不同水解酶对雪莲果叶总黄酮提取率的影响，得出各种水解酶的提取率依次为纤维素酶＞果胶酶＞蛋白酶。因此，可以看出纤维素酶的利用度最好。本试验选用纤维素酶进行酶解的原因除利用度较好外，还考虑到纤维素酶的特性。纤维素酶是专门用于降解纤维素的一种非单体的复合酶，是具有共同作用的多样化酶系，其中富含的酶活力越高产生的酶解产物越彻底[27-28]。本研究前期对比了多家公司生产的纤维素酶，最终选定酶活力相对较好的郑州宇控生物科技有限公司生产的纤维素酶。基于此上优点，本研究选用纤维素酶破坏植物细胞壁，利用超声波辅助酶解的优势使细胞内的活性成分和营养物质可以大幅度溶出，从而达到本试验目的。

本试验结果表明，超声波辅助酶解法提取新鲜枸杞叶黄酮的手段是切实可行的，经响应曲面法分析优化后得到新鲜枸杞叶黄酮的最佳提取条件为：超声温度60℃、超声功率300 W、料液比1∶30、乙醇体积分数65%，在此条件下，黄酮实际提取率为7.742 1%。此外，由抗氧化活性数据可以得出，最佳工艺条件制备所得的不同新鲜枸杞叶黄酮提取液质量浓度对各项自由基有不同的清除效果。当提取液质量浓度为5 mg/mL时，DPPH、·OH和ABTS自由基对应的清除率分别为86.48%、80.36%、67.06%。总之，采用超声辅助酶解提取得到新鲜枸杞叶中黄酮提取率较高，对进一步研究其功效具有深远意义。