不同固定液固定豚鼠视网膜效果的比较

邱 宇 高洪莲 张 磊

1 滨州医学院附属医院眼科 山东 滨州 256603;2 滨州医学院附属医院临床医学实验中心 山东 滨州 256603

近视是常见的眼科疾病[1]，高度近视眼底病变是致盲的主要原因，随着近视屈光度的增加和眼轴的增长，眼底病发生率升高，如后巩膜葡萄肿、黄斑劈裂、黄斑出血、豹纹状眼底等[2]。因此近视防控是社会关注的焦点，也是研究的热点。而豚鼠是建立近视模型中最常用的实验动物，其视网膜组织的病理切片在实验中有着重要作用，但因视网膜结构复杂，在制作视网膜组织病理切片时，易出现视网膜断裂折叠、细胞固缩、胞核不清等问题，影响实验研究。合适的固定液可以快速固定组织，避免组织自溶，维持组织细胞的正常形态结构，保留蛋白质等物质的抗原性[3]。既往对豚鼠视网膜病理切片的研究中，多聚焦于固定液对视网膜形态结构的影响[4]，固定液对豚鼠视网膜免疫组织化学研究是否有影响未见相关报道。本研究通过HE染色和免疫荧光检测技术，比较3种不同固定液对豚鼠视网膜组织形态结构和免疫组织化学研究的影响，以筛选出既能保留视网膜组织和细胞形态结构，又能不影响免疫荧光分析的固定液。

1 资料与方法

1.1 研究对象 取健康3周龄英国短毛三色豚鼠15只(济南西岭角养殖繁育中心提供)，雌雄不限，体质量150～200 g。实验动物的喂养和使用严格遵循滨州医学院动物管理委员会相关规定。

1.2 研究方法

1.2.1 分组与取材固定 颈椎脱臼处死各组豚鼠，冰上摘取眼球，将15只豚鼠的30只眼球按照随机数字表法分为3组，每组10只眼球，A组Davidson’s固定液固定3 h，B组Bouin’s固定液固定24 h，C组4%多聚甲醛固定液固定24 h。固定完成后取出眼球，观察眼球大体形态后去除角膜、虹膜、晶状体和玻璃体，制成眼杯。

1.2.2 石蜡切片制备 将固定好的眼杯依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋，选取视乳头附近进行连续切片，切片厚度4 μm，65 ℃烘烤1 h。

1.2.3 HE染色 石蜡切片脱蜡水化，苏木素染色8 min，自来水冲洗，分化液分化30 s，自来水浸泡15 min，伊红染色8 s，自来水冲洗并浸泡3 min，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，在显微镜下观察视网膜形态结构。

1.2.4 免疫荧光 石蜡切片脱蜡水化，置入枸橼酸钠缓冲液中加热修复2次，每次5 min， 0.3%Ttiton x-100洗3次，每次10 min，PBS洗3次，每次10 min，滴加5%BSA封闭液，37 ℃孵育30 min，滴加兔抗鼠TH多克隆抗体(1∶1 000)，37 ℃孵育过夜，PBS洗3次，每次10 min，滴加山羊抗兔IgG(Alexa Fluor 488)(1∶500)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min，滴加含DAPI的封片剂封片，正置荧光显微镜观察拍照。

2 结果

2.1 固定后的眼球标本大体观察 经不同固定液固定后，A组眼球饱满无凹陷，基本保持原有形态，颜色无明显变化；B组眼球饱满无凹陷，基本保持原有形态，但被固定液染色，颜色明显变黄；C组眼球局部皱缩凹陷，变形明显，颜色无明显变化。

2.2 视网膜HE染色结果 A组神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层等各层视网膜结构排列规整，未见明显断裂，细胞形态良好，胞间无裂隙，细胞核清晰可见； B组视网膜各层结构排列规整，未见明显断裂，但部分内核层细胞有轻微固缩，细胞核略有不清；C组视网膜有部分断裂，细胞固缩明显，胞间出现裂隙，尤其是内核层和外核层较为显著，细胞核不清(图1)。

A. Davidson′s固定液组；B. Bouin′s固定液组；C. 4%多聚甲醛固定液组。

2.3 免疫荧光结果 视网膜中TH表达呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。各组无长突细胞层均可见TH阳性表达，无明显差异，但C组细胞核染色略有不清，且因视网膜有局部断裂折叠，拍照取景较为困难(图2)。

A. Davidson′s固定液组；B. Bouin′s固定液组；C. 4%多聚甲醛固定液组。ONL,视网膜外核层，INL,视网膜内核层。

3 讨论

制备高质量的视网膜病理切片对于评估视网膜结构功能以及确定疾病机制具有重要意义，但由于视网膜结构的脆弱性和复杂性，保持视网膜组织细胞的形态结构完整较为困难[5]。有些固定液如10%中性甲醛可以很好地保护视网膜结构，但会增强背景荧光、减弱抗体和表位的相互作用，致使免疫荧光分析受阻[6]。本研究通过HE染色和免疫荧光技术，综合比较不同固定液对豚鼠视网膜组织的固定效果。

4%多聚甲醛固定液主要由多聚甲醛和磷酸盐组成，是最常用的固定液之一，能较好的保护组织和细胞的形态结构[7]，但本研究结果显示，4%多聚甲醛会使眼球过度脱水收缩，导致眼球凹陷变形，视网膜断裂折叠，细胞固缩明显，胞间出现裂隙，胞核不清，不利于视网膜组织和细胞的形态结构观察，对免疫荧光中细胞核的DAPI染色也有一定影响。

Bouin′s固定液是苦味酸、冰醋酸和甲醛的混合物[8]，苦味酸是一种缓慢穿透的固定剂，通过与基本蛋白质形成盐(苦味酸盐)来沉淀蛋白质，有利于蛋白质的保存，但会导致组织过度收缩[9]。乙酸不能固定蛋白质，但能凝固核酸，同时它的快速渗透和膨胀作用，抵消了苦味酸的部分收缩作用。本研究结果显示，Bouin′s固定液组的眼球基本无变形，视网膜各层结构排列规整，未见明显断裂，只有部分内核层细胞有轻微固缩，免疫荧光效果也比较理想。但固定液中的苦味酸具有强烈的刺激性和致敏性，同时会使与之接触的组织细胞、研究者的皮肤黄染，在高热、受到撞击时还可能发生爆炸，存在安全隐患[10]。

Davidson′s固定液是乙醇、冰醋酸和甲醛的混合物，已被提倡和广泛用于保存眼睛、骨髓、乳房、睾丸等组织[7]。相比Bouin′s固定液，Davidson′s固定液用乙醇取代了具有安全隐患的苦味酸，乙醇穿透迅速，但它和苦味酸一样也会导致组织过度收缩，同样的，乙酸的存在，抵消了这种收缩。既往研究表明，Davidson′s固定液在兔、大鼠和猫视网膜的固定中产生了更好的形态结构保存效果，并与视网膜免疫组织化学兼容[11-14]。 本研究结果显示，Davidson′s固定液在豚鼠视网膜石蜡切片中也有着良好的固定效果，眼球基本无变形，视网膜结构排列规整，未见明显断裂，细胞形态良好，胞间无裂隙，细胞核清晰可见，免疫荧光中未出现表位遮盖，可见目标因子的阳性荧光，细胞核的DAPI染色情况也比较理想。但需要注意的是，因Davidson′s固定液作用迅速，豚鼠眼球建议固定时间为3 h，此后应转移至10%中性甲醛或70%乙醇中保存，固定过度会导致视网膜形态结构不佳，免疫荧光检测中也会出现非特异性荧光[15]。

综上所述， Davidson′s固定液相较其他两种固定液更适合豚鼠视网膜组织的固定，在保留视网膜组织和细胞形态结构的同时不影响视网膜的免疫组织化学研究，Bouin′s固定液虽然有着相近的固定效果，但考虑到其存在较多的安全隐患，不建议作为固定液首先。本研究为豚鼠视网膜固定液的选择以及高质量视网膜病理切片的制备提供了参考。