鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞活力影响的比较研究

朱 琪，李秀丽，任卫科，江 珊，张 莉，王建国，鄢明华

(天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381)

鱼腥草(houttuynia cordata)作为传统中兽药在畜禽生产中应用广泛，前期研究表明，饲料中添加鱼腥草有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、提高生产性能等多重功效，从而达到抗病提高畜禽生产力的目的[1-3]。鱼腥草多糖(houttuynia cordata polysaccharide, HCP)是鱼腥草中提取的天热有效成分，其中单糖组成主要为木糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖[4-5]，研究表明其具有广谱的抗病毒作用，对多种病毒均有不同程度的抑制作用[6-7]。非洲绿猴肾细胞MA104及其单克隆得到的MARC145细胞是多种病毒的宿主，在体外研究中可以作为病毒复制的载体，尤其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)，牛/猪轮状病毒(bovine/porcine rotavirus, RV)和禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)等有很好的适应性[8-10]。探明HCP对MA104和MARC145细胞的毒性作用，以期为HCP体外药理研究提供试验支撑，为进一步研究其药理作用机理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 鱼腥草多糖的提取与配制 鱼腥草购自安国市友鑫中药材销售有限公司。

鱼腥草除杂、干燥、粉碎过40目筛，准确称量8 g，加入400 mL纯净水，水浴加热80 ℃回流提取6 h，重复三次；合并所得过滤液，旋转蒸发仪浓缩定容至40 mL(得鱼腥草水提物)，取20 mL浓缩液加入100 mL 95%乙醇进行醇沉过夜，待第2天有大量醇析物时，弃去上清液后，将醇析物水浴蒸干得鱼腥草粗多糖；粗多糖蒸馏水定容至30 mL，加入等量体积的Sevage试剂(氯仿﹕正丁醇=4∶1，体积比) 混合震荡30 min，离心取上清液，重复3次，多糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖绘制标准曲线，比较得出多糖浓度，计算公式如下：多糖得率=C×V×N/m×100%(C多糖浓度；V药品测试体积；N稀释倍数；m原料药初始质量)。

鱼腥草多糖含量的测定：绘制标准曲线，取分析纯无水葡萄糖干燥至恒重。精密称量60 mg，置于100 mL容量瓶中，加水定容，超声混匀，得葡萄糖对照品溶液。用移液枪取葡萄糖对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于50 mL的容量瓶中，加水定容并超声混匀，得对照品梯度溶液D1、D2、D3、D4、D5，备用。取对照品梯度溶液D1、D2、D3、D4、D5各2 mL于试管中，各加4%苯酚溶液1 mL混匀再迅速加入硫酸7 mL，摇匀。40 ℃水浴30 min，取出再冰浴5 min。以蒸馏水调零于490 nm处测定吸光度值，每组平行测定三次，取均值。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准曲线。多糖含量的测定，方法同上，代入得出的标准曲线方程中，计算浓度以及干燥产物的多糖含量。多糖提取流程图如图1所示。

图1 鱼腥草多糖提取流程图

1.2 细胞来源及培养 MA104和MARC145细胞购自ATCC细胞保藏中心。

复苏细胞：将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37 ℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4 mL培养基混合均匀。在1000 RPM条件下离心4 min，弃去上清液，补加2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜。检查细胞活力计数冻存，检测细胞和相关试剂支原体阴性备用，利用0.4%台盼蓝染色法检测活细胞率，进行细胞计数。

细胞生长培养基：DMEM(高糖型，含4500 mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110 mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)+8%胎牛血清+ 1%双抗(青霉素和链霉素)的培养液，调pH值为7.4；细胞维持培养基：DMEM+4%胎牛血清；冻存液：细胞生长培养基+10%胎牛血清+10% DMSO；消化液：0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

细胞培养条件：温度37 ℃；95%空气；5% CO2；湿度90%以上。细胞传代培养，复苏细胞每管接种T25培养瓶一个，细胞在刚长成细胞单层时记录并及时进行消化传代。按1∶3传代，细胞接种密度为1×105cells/mL，观察记录长成单层的时间。

1.3 细胞生长曲线的绘制 分别用细胞平板计数法和MTT法绘制细胞生长曲线：将长成单层的MA104/MARC145细胞从培养瓶内消化下来，吹打均匀后按0.5×104个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板中。每天取6孔细胞，消化后计数并取平均值，连续监测9 d；同时另铺板用MTT法检测各孔OD值，以天数时间为横坐标，细胞数/OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.4 鱼腥草多糖对细胞活力的影响 根据细胞生长曲线确定对数生长期为试验阶段，配制梯度浓度的HCP溶液(0、0.005、0.05、0.5、5、50 mg/mL)，将梯度浓度的HCP溶液孵育细胞24 h，MTT法检测细胞活力，每孔加MTT溶液10 μL，继续孵育4 h。终止培养吸出孔内培养液后，加入DMSO液(100 μL/孔)，室温下，平板置在微孔板震荡器上震荡10 min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值(λ=570 nm)，记录结果[11]。

1.5 数据统计 试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析，数据用“平均值±标准差”(x±s)表示，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。图集均由GraphPad Prism 6.0绘图软件制作。

2 结果与分析

2.1 鱼腥草多糖提取率 鱼腥草原药提取多糖通过以料液比1∶50，80 ℃热水回流浸提6 h，5倍乙醇沉淀，Sevage 法除蛋白，真空冷冻干燥获得。经葡萄糖标准曲线检测多糖浓度C为4.36 mg/mL，根据公式算得HCP提取率为8.18%。

2.2 细胞生长曲线绘制 由图2可知，细胞平板计数法绘制细胞生长曲线图呈S型，有明显的潜伏期、对数生长期和衰退期；MA104细胞峰值出现在第7天，而MARC145细胞峰值为第8天，MA104细胞的对数生长期为第4至第7天，而MARC145细胞对数生长期为第4至第8天。由图3所示，MTT法测得细胞生长曲线结果与图2细胞平板计数法相似。

图2 细胞计数法绘制MA104和MARC145细胞生长曲线图

图3 MTT法绘制MA104和MARC145细胞生长曲线图

2.3 梯度浓度鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞活力的影响 由图4可知，50 mg/mL的HCP对MA104细胞活力有抑制作用，且OD值显著低于对照组(P<0.05)；HCP浓度为0.05、0.5、5 mg/mL组细胞OD值显著高于对照组(P<0.05)， 0.005 mg/mL HCP细胞OD值与对照组无显著显著(P>0.05)。

由图5可知，50 mg/mL的HCP对MARC145细胞活性有抑制作用，且OD值极显著低于对照组(P<0.01)；HCP浓度为0.05、0.5、5 mg/mL的三组细胞OD值与对照组比较显著提高(P<0.05)；HCP浓度为0.005 mg/mL的细胞组，OD值与对照组差异不显著。

图4 鱼腥草多糖对MA104细胞活力的影响

图5 鱼腥草多糖对MARC145细胞活力的影响

2.4 鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞形态的影响 由图6可知，0 mg/mL的HCP(正常对照)处理24 h后，MA104和MARC145细胞形态正常，呈明显的铺路石样；0.5 mg/mL的HCP处理24 h后，MA104和MARC145细胞形态正常，比正常对照细胞间隙更紧密，折光率也更高；50 mg/mL的HCP处理24 h后，MA104和MARC145细胞形态出现变圆皱缩，个别细胞脱壁；500 mg/mL的HCP处理24 h后，MA104和MARC145细胞破裂聚集，产生大量细胞碎片，只见个别细胞贴壁，形态呈煎蛋样坏死。

图6 鱼腥草多糖对MA104和MARC145细胞形态的影响(200×)

3 讨论与结论

MTT法可直接检测活细胞中线粒体酶活性，MTT结晶形成的量和细胞数成正比，从而反映细胞数量和活力，因此，MTT法检测细胞活力更直接。本试验同时运用细胞平板计数法和MTT法检测细胞活力，结果显示两种方法绘制的细胞生长曲线基本相似，MTT法更方便直观，且在临床应用广泛[12]。因此，下一步药效学试验选取MTT法检测细胞活力。

本研究表明，高浓度HCP(50 mg/mL)对MA104和MARC145细胞活力有明显抑制作用，本试验观察到细胞形态明显收缩，可能与多糖改变细胞渗透压有关；0～0.005 mg/mL的HCP对MA104和MARC145细胞活力无显著影响；0.05～5 mg/mL的HCP对MA104和MARC145细胞活力有明显促进作用。前人研究表明，鱼腥草粗提物对MARC145细胞最大安全作用质量浓度为1.563 mg/mL[13]，本研究表明小于等于5 mg/mL的HCP对MARC145细胞安全，说明同浓度的HCP比粗提物对MARC145细胞更安全，毒副作用更低。不同制备方法配制成20 mg/mL的HCP对三种病毒均有抑制作用，且对RD细胞和Hep2细胞无毒副作用[6]，说明HCP对多种细胞具有较高的安全性，适用范围更广。300 μg/mL HCP对人结肠癌细胞LoVo、人肝癌细胞HepG2和小鼠白血病细胞L1201的生长均有显著的抑制作用[14]，提示其对细胞的影响具有双向调节作用。因此，本研究表明，梯度浓度的HCP对MA104和MARC145细胞活力的影响，可筛选促生长最佳浓度剂量范围和毒性剂量，为进一步开展后续研究奠定基础。

HCP(0～5 mg/mL)对MA104和MARC145细胞无毒性作用，为深入研究HCP的药理机制提供了试验依据。