鸡蛋及牛奶中四环素类药物残留量的液相色谱-串联质谱测定法

张崇威，李华岑，陈 蔷，彭 丽，张振宇，吴志明

(1.河南省兽药饲料监察所，郑州 450008；2.济源市畜产品质量监测检验中心，河南济源，459000)

四环素类药物属于对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均敏感的人工合成抗生素[1-2]，作用机理为其与细菌核蛋白体的30 s亚基团结合，阻止aa-tRNA同核蛋白体结合，从而阻止肽链延伸和细菌蛋白质合成[3]，作为一类广谱抗生素已被广泛应用于畜禽等养殖环节的疾病治疗中。但由于养殖户的滥用、盲用、不遵守休药期使用等多种原因，四环素类药物及其代谢物易在肝肾中富积并随乳汁分泌排出而流入食物链[4]，并且作为饲料添加剂，造成鸡蛋中药物残留问题不断增多，影响牙齿及骨骼发育、肠道菌群失调、细菌耐药以及环境污染等诸多问题[5]，因此，国内外都对四环素类药物残留实施了严格的监控[6]，我国在GB31650-2019中也明确规定：牛/羊奶中土霉素、金霉素、四环素单个或组合最大残留限量为100 μg/kg，鸡蛋中土霉素、金霉素、四环素单个或组合最大残留限量为400 μg/kg，多西环素为泌乳期禁用。目前尚无牛奶及鸡蛋中同时检测4种四环素类化合物残留检测的国标，且相关文献也较少，因此，对建立一种同时适用于牛奶及鸡蛋中4种四环素类药物残留检测方法具有重要意义。现有相关国家标主要为GB/T 21317-2007 动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法、农业部1025号公告-12-2008 鸡肉、猪肉中四环素类药物残留检测-液相色谱串联质谱法。前者定量限偏高，已与目前高灵敏度仪器不相符，且适用范围不包含鸡蛋基质，后者适用范围缺少多西环素物质。目前文献报道的方法主要有微生物法[7-10]、免疫检测法[11-13]、毛细管电泳法[14-16]、薄层色谱法[17]、高效液相色谱法[1,3,18-24]、液质联用法[25-30]，近年由于固相萃取柱(SPE)结合液相色谱串联质谱仪的普及，以及其高通量、高灵敏度、高效率的特性，越来越成为残留检测的主要手段。现有国标及文献报道的四环素类残留检测的提取液均以水相Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液为主，对于含有较细固体颗粒的样品，极易造成在前处理过程中SPE小柱净化浓缩时严重堵柱现象，无法继续过柱，造成实验失败。部分国标或文献采取部分提取液过柱的方法从而减少堵柱现象，但这大大降低了方法的灵敏度。本研究从优化前处理过程：将提取液过快速滤纸，并在HLB小柱内添加脱脂棉的方法，可将全部提取液净化浓缩，从而提高方法灵敏度，为四环素类残留的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 Waters Acquity UPLC - Xevo TQ-S 三重四极杆串联质谱仪(配电喷雾离子源)(waters公司)；ES3200型天平(感量0.01 g)(METTLER公司)；S470-K型酸度计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；3K-30型台式高速冷冻离心机(德国sigma公司)；TARGIN TECH VX-03多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司)；TTL-DC II型24位水浴氮吹仪；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；KQ 5800 B型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；IKA MS3 Basic圆周振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)。

1.2 对照品与试剂 四环素、土霉素、金霉素、多西环素标准品均购自中国兽医药品监察所，含量分别为95.0%，97.6%，92.1%，85.2%。乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)，优级纯；磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，分析纯；柠檬酸(C6H8O7·H2O)，分析纯。Mcllvaine-Na2EDTA缓冲盐：将37.2 g C6H8O7·H2O，27.6 g Na2HPO4·12H2O，37.2 g Na2EDTA·2H2O溶于1000 mL水中，混匀即得。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，购自Fluck公司；HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，用前在管中加入适量脱脂棉)，天津市天兴达科技有限公司；水为一级水。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制 分别精密称取4种四环素类药物各约10 mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL四环素类药物的标准贮备液。准确吸取0.1 mL标准贮备液至另一10 mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并稀释至刻度，配制成10 μg/mL标准工作液。

1.3.2 样品采集与制备 鸡蛋采自超市，牛奶采自奶牛养殖基地。经检测均无四环素类药物残留。将鸡蛋蛋清蛋黄均质匀浆，同牛奶分别置于50 mL离心管备用。

1.3.3 样品前处理 提取：取试料2 g(精确至±0.05 g)，于50 mL聚丙烯离心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液10 mL，振荡10 min，低温(5 ℃)14000 r/min离心10 min，吸取上层液体于另一50 mL离心管中。重复用10 mL Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取1次，合并提取液并混匀，低温(5 ℃)14000 r/min离心10 min，取鸡蛋试样上清液备用；奶试样上清液经快速滤纸过滤后备用。净化：固相萃取柱依次用甲醇、水各3 mL活化，备用液过柱，用水3 mL，5%甲醇(V/V)3 mL淋洗，抽干，甲醇3 mL洗脱，抽干，收集洗脱液于带刻度的玻璃管中，于45 ℃下氮气吹至液体小于1 mL，加30%甲醇至1.00 mL，涡旋混匀，溶液浓度超出曲线范围时需用空白基质复溶液(按该处理方法处理空白样品至“加30%甲醇至1.00 mL”混匀即得)稀释至溶液浓度在曲线浓度范围内，过0.22 μm 微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.4 仪器条件 色谱参考条件：色谱柱为Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序见表1；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱条件

质谱参考条件：离子源：电喷雾(ESI)离子源；扫描方式：正离子；检测方式：多反应离子监测(MRM)；电离电压：3.3 kV；锥孔电压：25 V；源温：150 ℃；脱溶剂气温度：450 ℃；锥孔气流速：150 L/h；脱溶剂气流速：800 L/h；定性、定量离子对、离子源、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞能量

1.3.5 基质标准曲线的制备 准确量取标准溶液(1.3.1项)适量，用30%甲醇稀释成浓度为100 ng/mL的标准中间液。分别准确量取标准中间液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL于空白基质洗脱液液中(空白基质洗脱液：按1.3.3项方法处理样品至“甲醇3 mL洗脱”时所收集的液体即为空白基质洗脱液，下同)，并同样品同步处理后供液相色谱-串联质谱仪测定。按对照溶液浓度及相应峰面积作标准曲线，并计算回归方程及相关系数。

1.3.6 方法灵敏度确定 采用空白样品中添加目标化合物的方法，依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N≥3 的浓度为方法检测限，S/N≥10的浓度为方法定量限，添加适量标准溶液于2 g空白试样中，制备得到一定浓度的添加样品，经前处理后检测，在相应的保留时间，空白试样对所测药物无干扰，测定灵敏度。

1.3.7 准确度和精密度的测定 采用标准添加法，分别准确称取空白样品2 g，添加一定体积的标准工作溶液，使样品中各药物浓度分别为LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL(土霉素、四环素及金霉素)与LOQ、2LOQ、10LOQ(多西环素)，按1.3.3项方法处理后进行测定，一日内每种药物每个添加浓度取5个平行样品分别进行测定，重复测定3 d，外标法基质标准曲线定量，计算回收率和批内、批间相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 基质匹配标准曲线 准确量取浓度为100 ng/mL的混合标准中间液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL于空白基质洗脱液(1.3.5项)中，N2吹至小于1 mL，加30%甲醇至1.00 mL，充分混匀，过微孔滤膜，作为基质匹配标准溶液上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，4种药物的回归方程及相关系数r见表3，由表3可见，4种药物在5～100 μg/kg的浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数r均大于0.9990。图1为空白鸡蛋中添加浓度为10 μg/kg的特征离子质量色谱图。

表3 回归方程相关系数

图1 空白鸡蛋中添加10 μg/kg四环素类药物特征色谱图

2.2 方法灵敏度 按1.3.3项所述方法进行处理，依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N≥3的浓度为方法检测限，S/N≥10的浓度为方法定量限，得出四环素类化合物在鸡蛋及牛奶中的检测限均为2 μg/kg，定量限均为5 μg/kg。空白鸡蛋中添加5 μg/kg四环素类药物的特征离子质量色谱图见图2。

图2 空白鸡蛋中添加5 μg/kg四环素类药物特征色谱图

2.3 方法准确度及精密度 在空白鸡蛋及牛奶中添加土霉素、四环素、金霉素的LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL及多西环素LOQ、2LOQ、10LOQ等不同浓度的添加量进行回收率实验，结果汇总见表4、表5，可知，四环素类药物在该添加浓度水平范围内，在鸡蛋基质中回收率范围为81.5%～110.0%之间，在牛奶基质中回收率81.2%～109.8%之间，批内批间RSD均小于11.4%。结果表明本方法定量准确，重复性好。

表4 空白鸡蛋中添加四环素类药物回收率试验结果

续表

表5 空白牛奶中添加四环素类药物回收率试验结果

3 讨论与结论

3.1 提取溶剂及添加量的选择 考虑到四环素类药物具有较强的极性，易与金属离子螯合形成配合物[31]，影响其溶解性，且易与生物样品中的蛋白质形成共轭物，以上两点造成提取困难，回收率低，同时还需考虑到沉淀蛋白的操作，因此，提取生物样品时往往需加入金属络合剂和强酸或酸性去蛋白试剂，Mechael[32]等报道了沉淀蛋白的多种处理方式，如溶剂萃取、有机溶剂与酸性化合物混合提取、1%三氯乙酸等，本研究在考虑这些方法的同时，也考察了乙酸锌和亚铁氰化钾(1∶1)、硫酸铵、低浓度硫酸水溶液等，均不同程度使回收率明显降低，甚至无法检测到目标物，例如加入硫酸水溶液，而有机溶剂易造成蛋白变性，提取率低。因此，拟采用含金属络合剂的酸性水相提取液。本方法参考了国家标准(GB/T 22990-2008、农业农村部1025号公告-12-2008、GB/T 21317-2007)、美国农业部FSIS官方的分析方法以及其他的相关文献，提取液采用了Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液(pH 4.0)进行提取。依据GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测中附录F检测方法确认的技术要求，本研究对已制定最高残留限量的四环素、土霉素、金霉素的添加量在LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL水平，对禁用物质多西环素的添加量在LOQ、2LOQ、10LOQ水平，且回收率均满足该规范的要求。

3.2 净化条件选择 参照国标GB/T 21317-2007、农业农村部1025号公告-12-2008等，本试验优先选择规格为60 mg/3 mL的HLB固相萃取柱，但在试验过程中出现严重堵柱现象，通过对比Waters HLB与国产HLB固相萃取柱，同时采用低温高速离心，发现国产HLB 柱过柱过程优于Waters HLB。在过滤环节，本研究比较了定性滤纸与定量滤纸的差别，定量滤纸出现堵塞现象，而快速定性滤纸过滤效果明显且过程顺利，同时在净化柱内添加脱脂棉后，堵柱现象明显改善，取得了满意效果。但鸡蛋过滤纸后，在过固相萃取柱时出现了严重堵柱现象，反而未过滤纸的提取液比较容易过萃取柱，考虑为鸡蛋式样中的脂溶性物质较多，利于试样的过柱，故鸡蛋采取提取液经高速冷冻离心后直接过柱。此操作使得四环素类药物在鸡蛋及牛奶中回收率范围在81.2%～110.0%之间，批内、批间变异系数均小于11.4%，定量限为5 μg/kg。优于E Yoshida[31]等报道 的牛奶基质中四环素类药物回收率范围为70%～120%、变异系数小于25%、定量限为10 μg/kg以及Michael[32]等报道的鸡蛋基质中四环素类回收率范围为45%～55%、定量限为10～50 μg/kg。净化效果显著。

3.3 质谱条件优化 将适当浓度的四环素类单标溶液进样，以正离子模式进行一级质谱图扫描，发现各化合物的[M+H]+峰较强，选择[M+H]+作为母离子，进行子离子扫描，并从中选择响应值较高的两个子离子分别是定量离子和定性离子。根据欧盟2002/657/EC要求，要确证该类物质至少需要3个识别点(IP)，因此，分别选择了母离子以及对应的两个响应较强的子离子作为定性定量依据，这样一个母离子1个IP点，对应两个子离子分别1.5个IP点，满足3个IP点的要求，符合了欧盟有关法规的要求。另外，实验比较了氮气吹干后加1.00 mL 30%甲醇复溶及氮气吹至小于1.00 mL后加30%甲醇定容至1.00 mL，后者方法回收率明显提高，考虑原因为四环素类特别是多西环素药物在高热干燥的环境下分解速度加快。

4 实际样品检测

采用本方法对市场上购买的98批鸡蛋及100批牛奶样品进行检测分析，结果显示：9批鸡蛋样品检出土霉素，结果为5.68～53.2 μg/kg，3份鸡蛋检出金霉素，结果为8.51～26.5 μg/kg，3批鸡蛋检出多西环素，结果为11.6～256 μg/kg。1批牛奶检出多西环素，结果为11.1 μg/kg。说明在养殖环节中存在使用该类药物的现象，此方法可用于鸡蛋及牛奶中四环素类化合物残留的测定，降低食品安全隐患。

本研究通过优化样品提取净化分离条件，建立了利用液相色谱-串联质谱检测鸡蛋及牛奶中四环素类药物残留量的方法，与国标GB/T 21317-2007及农业农村部1025号公告-12-2008方法相比，提高了方法灵敏度，弥补了国标方法适用基质范围窄的问题，重现性好，操作简便，能够满足对鸡蛋及牛奶中四环素类药物残留分析检测，为兽药残留检测工作提供技术支持。