银翘散对急性肺损伤模型小鼠肺损伤的改善及作用机制*

王逸凡，杨居崩，赵显芳，聂发龙，李秀芳

（云南中医药大学药理教研室，云南 昆明 650500）

中性粒细胞是机体固有免疫防御系统的重要组成［1］。2004年，BRINKMANN 等［2］首次发现了中性粒细胞对抗感染的新方式，即形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。NETs 由薄的染色质纤维组成，包含髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）、防御素、抗菌肽等30 种中性粒细胞蛋白［3］。受到促炎介质、过氧化物等刺激后，中性粒细胞也可形成NETs［4］。在脂多糖诱导的新生小鼠急性肺损伤（ALI）模型中，支气管肺泡灌洗液及NETs 的游离DNA 水平均升高，使用NETs 抑制剂脱氧核糖核酸酶（DNase）后，模型小鼠ALI 症状缓解，提示NETs 的产生可造成肺组织损伤［5］。银翘散对病毒感染及由脂多糖诱导的小鼠ALI具有防护作用，可对抗氧化应激损伤，抑制白细胞介素6（IL - 6）、白细胞介素1（IL - 1）、肿瘤坏死因子- α（TNF- α）等炎性因子的释放［6-7］。本研究中探讨了银翘散通过抑制NETs 的形成而改善脂多糖诱导的小鼠ALI 的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：XS125A 型分析天平（瑞士普利赛斯公司，精度为十万分之一）；Infinite M200 PRO 型酶标仪（瑞士Tecan 公司）；cf16RX 型低温高速离心机（日本Hitachi Koki 公司）；OSE-Y50 型高速组织研磨器（天根生化科技＜北京＞有限公司）；Ti-S型倒置相差显微镜、Ci-L型正置荧光显微镜（日本Nikon 公司）；EG1150 型石蜡包埋机、RM2235 型手动轮转式切片机（德国徕卡仪器有限公司）。

试药：银翘散组方药材购自云南慈慧药业有限公司，制备工艺参考文献［8］；脂多糖（美国Sigma 公司，货号为O111：B4，批号为019M4009V）；兔来源抗CitH3 抗体（批号为GR - 13294584），兔来源抗MPO 抗体（批号为GR3243222 - 17），均购自英国Abcam 公司；DAPI 染料（批号为20200630），驴血清（批号为20200818），DNase I（批号为20200630），均购自北京索莱宝科技有限公司；异硫氰酸荧光素（FITC）山羊抗兔荧光抗体（批号为20000168），四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）山羊抗兔荧光抗体（批号为20000054），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（批号为20000243），抗甘油醛- 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号为00083126），均购自美国Proteintech Group公司。

动物：健康雄性KM 小鼠，60 只，体质量17～20 g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号为SYXK（川）K2020 - 030，合格证号为51203500017366。饲养环境为温度18～22 ℃，相对湿度40%～60%，明暗交替（12 h/12 h）。动物实验经云南中医药大学动物实验伦理委员会批准，动物伦理审查编号为R -06202009。

1.2 方法

分组、造模与给药：按随机数字表法将60 只KM 小鼠分为阴性对照组、模型组、银翘散组、DNase Ⅰ组，各15 只。银翘散组小鼠灌胃给予银翘散（按生药和体质量计72.54 g/kg），阴性对照组、模型组、DNase Ⅰ组小鼠均灌胃给予等体积生理盐水［9］，每天1 次，连续3 d。造模前均禁食不禁饮8 h。末次给药30 min 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰卧位固定于手术板上，颈部皮肤消毒，纵向切开，剥离皮下组织，暴露气管，于气管内滴注脂多糖生理盐水溶液（5 mg/kg），阴性对照组同法滴注等体积生理盐水。随后立即直立小鼠，上下轻度晃动数次，使脂多糖均匀分布于肺部，DNase Ⅰ组小鼠滴注脂多糖10 min 后再同法滴注DNase Ⅰ（5 mg/kg），缝合伤口，待小鼠自然清醒［10-11］。

指标观察及检测：1）肺湿/干重比（W/D）。模型复制6 h 后处死小鼠，无菌条件下迅速取出肺组织。取左肺上叶，准确称定质量并记录湿重（W），放入恒温80 ℃干燥箱中烘烤72 h，称定质量，并记录干重（D），计算W/D。2）肺组织形态。取右肺中叶，用10%多聚甲醛固定48 h，脱水，浸蜡，石蜡包埋，制成4 μm薄片，用苏木精-伊红（HE）染色，于显微镜下观察。3）MPO 和CitH3 的表达水平。取右肺上叶，采用蛋白免疫印迹法检测MPO 和CitH3 的表达水平；取左肺中叶，采用免疫荧光法检测MPO和CitH3的荧光表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 10.0 统计学软件分析。计数资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD 法，方差不齐者采用Tamhane's法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织W/D

与阴性对照组比较，模型组小鼠肺组织W/D 显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，银翘散组W/D 显著降低（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组小鼠肺组织W/D比较（±s）Tab.1 Comparison of W/D of lung tissue of mice in each group（±s）

表1 各组小鼠肺组织W/D比较（±s）Tab.1 Comparison of W/D of lung tissue of mice in each group（±s）

注：与阴性对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05。图3同。Note：Compared with those in the negative control group，*P ＜0.05；Compared with those in the model group，#P ＜ 0.05（for Tab. 1 and Fig.3）.

W/D 5.45±0.807.21±1.88*组别阴性对照组（n=14）模型组（n=13）W/D 6.12±1.11#6.03±1.53#组别银翘散组（n=12）DNase Ⅰ组（n=9）

2.2 肺组织病理形态学变化

阴性对照组小鼠肺泡结构完整，支气管和血管周围未见明显炎性变化；模型组小鼠肺毛细血管通透性增高，肺部水肿，肺组织间隙可见大量中性粒细胞浸润和红细胞渗出；银翘散组和DNase Ⅰ组小鼠肺组织病变均较模型组减轻，气道周围及肺组织炎性细胞浸润减轻。详见图1。

2.3 肺组织中MPO 和CitH3 免疫荧光表达

与阴性对照组比较，模型组小鼠MPO和CitH3的荧光表达水平均升高；与模型组比较，银翘散组小鼠MPO和CitH3的荧光表达水平均下降。详见图2。

2.4 肺组织中MPO 和CitH3 的蛋白表达水平

与阴性对照组比较，模型组小鼠肺组织中MPO 和CitH3 表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，银翘散组小鼠肺组织中MPO 和CitH3 表达水平均显著降低（P＜0.05）。详见图3。

3 讨论

ALI是由多种诱因引起的以急性、进行性呼吸功能不全为特点的常见临床危重症，严重时表现为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）［12］。ALI/ARDS 由直接或间接的过度肺部损伤和全身性炎性反应引起，其中NETs 发挥了重要作用［13］。新型冠状病毒肺炎（COVID - 19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的呼吸道疾病，可能发展为ARDS［14］。COVID-19 感染患者气道腔内的NETs，促进血纤蛋白沉积和微血栓形成，阻塞肺泡和细小血管，导致气管堵塞和肺通气障碍［15］。COVID- 19 严重感染患者的肺中存在多个广泛分布的NETs 浸润区域，NETs 通过促进纤维细胞的分化，从而加重肺部纤维化［16］。中性粒细胞形成NETs，可增强其直接杀灭或间接干扰病原体扩散的作用，阻止上呼吸道感染的进一步发展。但过度激活的中性粒细胞在肺部形成大量的NETs，会直接加剧肺组织的损伤，推动呼吸道感染的恶化进程。

CitH3 的生成可反映NETs 水平。组蛋白瓜氨酸化后，核小体中组蛋白和DNA 间的紧密静电结合被削弱，随后DNA 骨架解螺旋，NETs 形成［17］。而组蛋白在体内外均可对上皮细胞产生细胞毒性作用，加重ALI 症状［18］。MPO 可导致体外肺上皮和内皮细胞死亡，表明MPO 对肺泡-毛细血管屏障有直接毒性作用［19］，其表达也可反映NETs 水平。本研究中模型组小鼠肺组织中NETs 水平较高，且肺组织炎性细胞浸润严重，可能是NETs 中MPO 与CitH3 等对肺组织的损伤造成的。中医认为，ALI主要由肺部损伤以致肺失宣降、郁热内生，影响水液的输布和排泄导致［20］。银翘散主要由金银花、连翘、桔梗、甘草、薄荷、牛蒡子等组方，具有疏散风热、辛凉宣散、清热解毒、开宣肺气、止咳等功效［21-24］。本研究结果显示，银翘散可缓解ALI 模型小鼠肺部炎症的渗出和水肿，且小鼠肺组织中NETs 形成相关蛋白MPO 和CitH3表达水平均降低，提示银翘散可能通过抑制NETs 的形成而减轻ALI，但其具体作用机制还需进一步研究。