运用多重PCR技术建立一种田螺的基因检测方法

◎ 胡江如，蒋 艳，韩素素，胡 爽，徐帅磊，粟金岭，陈正培

（1.柳州工学院 招标采购中心，广西 柳州 545616；2.柳州工学院 食品与化学工程学院，广西 柳州 545616；3.柳州工学院 机械工程学院，广西 柳州 545616）

螺蛳粉是广西壮族自治区柳州市的特色小吃之一，具有辣、爽、鲜、酸和烫的独特风味。汤料是螺蛳粉的核心，对螺蛳粉的风味及营养有重要的影响，其中的田螺是螺蛳粉汤料风味独特的必备原料，当其在汤料中比例过小时，会严重影响螺蛳汤的色泽及风味，让其平淡无奇，没有特色[1]。PCR技术在食品检验中具有十分明显的优越性，通过高温变性、低温退火及中温延伸3步循环操作实现目的基因的扩增，从而对目标物种进行鉴定[2-4]。本研究基于PCR技术建立一种田螺的基因检测方法，在推动螺蛳粉标准化生产、提高监督效率、降低监督成本和维护消费者权益方面具有重要意义[5-7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

石螺、田螺、花甲和车螺，均购于广西柳州雒容综合市场。

1.1.2 试剂与药品

乙二胺四乙酸（分析纯），广东省化学试剂工程技术研究开发中心；硼酸（分析纯），广东省化学试剂工程技术研究开发中心；三（羟甲基）氨基甲烷TRIS，北京索莱科技有限公司；琼脂糖，北京莱博润科生物科技有限公司；PCR酶制剂，北京博迈德生物科技有限公司；DL 107-01组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒（50次），北京博迈德生物科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

T100 PCR扩 增 仪，BIO-RAD；GenoSens 1880凝胶成像分析系统，上海勤翔科学仪器有限公司；DYY-6D型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；Eppendorf 5425型离心机，德国艾本德股份公司；移液枪，德国艾本德股份公司。

1.2 PCR引物的选择

利用田螺DNA序列设计5对引物，具体如表1。

表1 特征性引物表

1.3 基因组DNA的提取与引物的组合

每种动物活体解剖去壳后，取前端软体组织，利用液氮将其磨碎成粉，参照试剂盒说明书提取DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。提取出DNA后，利用单细胞PCR技术得到扩增结果较好的引物组别，并将其排列组合后进行多重PCR的扩增。得到最佳组合后对其进行田螺的特异性检验。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取

运用柱层析法提取DNA，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测出车螺、石螺、田螺和花甲。由图1可知，4种样品的DNA均被提取出来，与预期结果相符。

图1 4种基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果图

2.2 田螺DNA的单引物扩增结果

用5对引物分别对田螺基因组DNA进行PCR扩增，同时进行退火温度的优化，PCR产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。由图2可知引物3、引物4、引物5的F及R进行PCR扩增时，田螺出现相应的扩增产物，且扩增效率较好，退火温度以60 ℃最佳；利用引物2扩增时，扩增效率较差；利用引物1进行扩增时没有获得扩增产物。

图2 田螺基因组DNA的5组引物扩增结果图

2.3 田螺DNA的双重引物扩增结果

将扩增效率较好的引物3、引物4和引物5进行组合，然后进行PCR扩增，扩增产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。由图3可知，组合②④即F4+R4、F4+R5，F3+R4、F3+R5的扩增效果较好。

图3 双重引物对田螺DNA的扩增结果图

2.4 验证双重引物对田螺DNA扩增的特异性

用优化的双重引物F4+R4/F4+R5分别对石螺、田螺、花甲和车螺4种样品的基因组DNA进行PCR扩增，采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。由图4可知，田螺出现扩增产物，其他样品没有出现，说明优化的双重引物只对田螺的DNA片段具有较好的特异性。

图4 双重引物对4种软体动物DNA的扩增结果图

3 结论与讨论

PCR技术作为一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法，因其具有特异性强、灵敏度高、检测速度快和准确性好等优点，已经被广泛应用于水产、微生物检测、临床微生物和食品中各种动物源性成分的检测等，而多重PCR是可以同时针对几个目标片段进行检测的PCR技术。国内外研究者利用多重PCR技术进行了很多研究，但研究多集中在螺蛳以外的畜肉及禽肉，螺蛳和畜肉的组合研究及螺蛳和禽肉的组合研究很少有报道[8-11]。本文通过运用多重PCR技术建立了一种高效的田螺目的基因检测方法，为螺蛳粉汤料真伪鉴定提供了技术支持。