漆酶固定化的工艺优化研究

◎ 杨静思，刘玲怡，韩 琴，赵玉英，尹晟旭，刘太林

（天津天狮学院 食品工程学院，天津 301700）

漆酶是多酚氧化酶中一种含多个铜离子的糖蛋白氧化酶，其来源广泛，在高等植物、真菌、细菌和动物等中都能发现[1]。漆酶是由日本学者研究发现，距今已有100多年，其中研究最广泛的是真菌漆酶，不同来源的漆酶结构功能上都有一定的差异[2-3]。漆酶是一种绿色生物催化剂，反应产生水，能与抗坏血酸、胺、酚等物质反应，还能催化氧化多种难以降解的氯酚类污染物、染料、多环芳烃、生物色素、氯仿、苯系物及其衍生物以及山硝基甲苯等。其主要应用于催化底物、食品加工、生物检测、工业废水和造纸废水处理等方面；但是游离的漆酶对外界敏感、稳定性差、易失活，不利于回收重复利用。对漆酶进行固定化研究不仅能解决这些问题，还能节约成本提高漆酶利用效率[4]。

固定化酶是指用某些载体和某些方法将游离的酶限制在一定的空间或吸附在某些载体上，使之不能随意移动，但仍具有活性结构和功能[5]。酶的固定化显著提高了酶的稳定性、重复利用率、抗逆性，受外界影响较小，使得酶可以在反应中重复利用。目前酶的固定化载体非常多，常用的有壳聚糖、尼龙网、二氧化硅、复合材料和活性炭等。固定化的方法有交联法、吸附法、共价结合法、热处理法和包埋法等[6]。酶固定化的核心要点是酶活性基本不降低，不影响酶的活性中心和结合位点，且其与载体结合牢固，不易脱落[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

漆酶（上海宝曼生物科技有限公司）；尼龙网、2,2’-联氮双（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）、二铵盐（ABTS，酷尔化学科技有限公司）；一次性注射器、海藻酸钠（天津市光复精细化工研究所）；柠檬酸（天津市大茂化学试剂厂）；戊二醛、Na2HPO4、NaH2P04、HCL、CaCl2及甲醇溶液，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AR124CN电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；UV-1000紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；XMTD-204数显式电热恒温水浴锅（天津市欧诺仪器有限公司）；WE-1水浴恒温振荡器（天津市欧诺仪器有限公司）；DT5-6B低速自动平衡离心机（北京时代北利离心机有限公司）；SB-3200DTDN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；pH计（上海般特仪器制造有限公司）；BCD-254冰箱（博西华家用电器有限公司）；G90F23CN3LV-C2（S5）微波炉（广东格兰仕微波生活电器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 游离酶活力的测定

称取1 g漆酶溶于40 mL蒸馏水中，搅拌均匀后2 000 r·min-1离心10 min，分离出上清液即为游离酶溶液，用于测定初始的酶活力；再取1 mL酶液，加入4.6 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，0.4 mL ABTS，利用分光光度计在420 nm处测定从起始到结束的吸光度值，然后根据公式（1）计算酶活力[8]。

1.3.2 固定化漆酶的制备

（1）包埋法固定漆酶。称取一定量的海藻酸钠，加入蒸馏水，置于微波炉中加热使之溶解成均匀的海藻酸钠胶体；取1 mL酶液加入到4 mL海藻酸钠胶体中并搅拌均匀使其充分混合，然后用带针头的注射器将混合好的海藻酸钠酶液逐滴滴入CaCl2溶液中，尽可能形成形状大小相似的均匀球状凝胶颗粒（2～3 mm），静置20 min后，放于水浴摇床上振荡固定。将振荡完毕的固定化漆酶取出，用布氏漏斗滤去氯化钙溶液，再用蒸馏水洗涤固定化漆酶凝胶颗粒，重复操作3次，以除去未固定化的氯化钙，放于室温下干燥，得到干燥固定化漆酶[9]。

（2）交联法固定漆酶。对张书祥等[10]的试验方法加以改进。取1 g尼龙网（1 cm×1 cm）洗净、晾干，用18.6%CaCl2、18.6%水的甲醇溶液在室温下保温10 min，洗净后吸干；于3.65 mol·L-1HCl中水解45 min，洗至pH中性，吸干；用不同浓度戊二醛进行交联后取出并洗去多余戊二醛，立即加入适量酶液并在4 ℃下固定，用缓冲液清洗后得到固定化漆酶。

1.3.3 固定化漆酶活力测定

取1.3.2制备的固定化漆酶，加入4.6 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，0.4 mL ABTS在420 nm处测定从起始到结束的吸光度值，根据公式（1）计算酶活力。

1.3.4 结果计算

利用试验中测定的吸光度值，计算固定化漆酶活力，计算公式如下[11]。

式中：A1为起始时的吸光度值；A2为结束时的吸光度值；t为吸光度值从A1增加到A2所经历的时间，s；ε为消光系数 3.6×104［(mol·L-1)·cm］-1。

1.3.5 单因素试验设计

以漆酶活力回收率作为指标，分别对以下因素水平进行单因素试验设计。

（1）包埋法固定漆酶。海藻酸钠质量分数分别取2%、3%、4%、5%和6% 5个不同质量分数。固定化温度分别设置45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃ 5个不同温度水平。CaCl2溶液浓度分别取 0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1和 0.6 mol·L-15 个不同浓度。

（2）交联法固定漆酶。戊二醛质量分数分别取3%、4%、5%、6%、7%和8%。交联时间分别设置为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h。固定时间分别设置为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 和 6 h。

1.3.6 正交试验设计

根据单因素试验结果，分别对不同因素选取3个酶活力回收率最高的因素水平进行L9(34)正交试验，以获得最佳固定条件，见表1、表2。

表1 包埋法固定漆酶正交试验设计表

表2 交联法固定漆酶正交试验设计表

2 结果与分析

2.1 包埋法固定漆酶单因素试验结果分析

2.1.1 温度对固定化漆酶的影响

不同温度对固定化漆酶的影响见图1。随着温度的增加，固定化漆酶的活力回收率也在增加，当温度达到55 ℃时，固定化酶活力回收率达到了最大，当温度继续升高时，固定化酶活力回收率开始下降。温度过高反而会降低漆酶的活性，因此选择55 ℃为最佳固定温度。

图1 温度对固定化酶活力回收率的影响图

2.1.2 海藻酸钠质量分数对固定化漆酶的影响

不同海藻酸钠质量分数对固定化漆酶的影响见图2。固定化漆酶的活力回收率随海藻酸钠质量分数的增长而增长，当海藻酸钠质量分数到达3%时，酶活力回收率最高，随后大幅度降低。这是因为海藻酸钠的浓度在适当范围内有利于微球成形，当海藻酸钠浓度较大时，成球不规则，载体通透性会降低，导致酶活力回收率降低[12]。

图2 海藻酸钠质量分数对固定化酶活力回收率的影响图

2.1.3 氯化钙浓度对固定化漆酶的影响

氯化钙浓度对固定化漆酶的影响见图3。当氯化钙浓度为0.2～0.4 mol·L-1时，随着浓度的增大，固定化漆酶的活力回收率也逐渐升高，当浓度达到0.4 mol·L-1时，酶活力回收率达到了最大，当浓度逐渐上升时，酶活力回收率出现下降趋势。这是由于CaCl2浓度过低时固定化凝胶比较松散，凝胶孔径比较大，酶容易流失。而CaCl2浓度过高时，分布在凝胶表面的Ca2+会增多，并与酶发生反应导致固定化酶活力降低[13]。

图3 氯化钙浓度对固定化酶活力回收率的影响图

2.2 交联法固定漆酶单因素试验的结果分析

2.2.1 戊二醛浓度对固定化漆酶的影响

不同戊二醛质量分数对固定化漆酶的影响见图4。随着戊二醛质量分数的增加，漆酶的活力回收率也随之增加，在戊二醛质量分数为5%时，酶活力回收率达到最高，而后下降。这主要是因为过量的戊二醛可能会导致蛋白质变性，降低酶活性，从而影响酶活力回收率；此外，当戊二醛质量分数过大时，戊二醛易发生自联反应，且聚集体过密阻碍了酶与底物的接触[14]。

图4 戊二醛质量分数对固定化酶活力回收率的影响图

2.2.2 交联时间对固定化漆酶的影响

交联时间对固定化漆酶的影响见图5。固定化漆酶活力回收率随着交联时间的增加而增加，并在交联时间为4 h时，酶活力回收率达到最大，而后大幅度下降。这可能是由于随着交联时间的延长，结构越来越紧密，使得固定化酶的传质阻力加大，造成酶活力降低，且长时间低温下的交联反应也会影响酶的活性[15]。

图5 交联时间对固定化酶活力回收率的影响图

2.2.3 固定时间对固定化漆酶的影响

固定时间对固定化漆酶的影响见图6。随着固定时间的增加，酶活力回收率增加，在4 h时酶活力回收率最大，固定效果最好。之后再延长固定时间，酶活力回收率不仅无明显提高，反而下降。这是因为固定时间过长可能会导致结构过于紧密，底物不易扩散，从而影响酶促反应速率，因此选择固定时间为4 h。

图6 固定时间对固定化酶活力回收率的影响图

2.3 正交试验结果

2.3.1 包埋法固定漆酶正交试验结果

以固定化漆酶活力回收率为参考指标，由表3可知，各因素对酶活力回收率的影响大小依次为温度＞海藻酸钠质量分数＞氯化钙浓度。从k值分析来看，在温度55 ℃、海藻酸钠质量分数3%、氯化钙浓度为0.4 mol·L-1为固定漆酶的最佳工艺条件。由表4方差分析来看，温度对酶的活力回收率影响显著，海藻酸钠质量分数和氯化钙浓度影响不显著。将正交试验得到的最佳组合条件：温度55 ℃、海藻酸钠质量分数3%、氯化钙浓度0.4 mol·L-1进行3次平行试验，通过验证试验发现，在该条件下固定化漆酶的活力回收率分别为88%、89%、88%，均优于其他方案结果，且RSD值为0.80%＜5.00%，因此此最佳试验条件得到验证。

表3 包埋法固定漆酶正交试验方案和结果表

表4 包埋法方差分析表

2.3.2 交联法固定漆酶正交试验

以固定化漆酶活力回收率为参考指标，由表5正交试验R值分析可知，3个因素对固定化漆酶的影响显著性依次为固定时间＞交联时间＞戊二醛质量分数，说明固定时间对固定化漆酶的活力回收率的影响最为显著。综合考虑各因素，确定固定化漆酶的最佳交联条件为5%戊二醛质量分数、4 h交联时间、4.5 h固定时间。由于得到的最佳固定化条件没有在正交试验设计的9组试验方案中，因此需要对该理论最佳条件做验证试验来验证该方案的可靠性。通过验证试验发现，在该条件下固定化漆酶的活力回收率分别为82.2%、82.5%、81.8%，高于正交试验中最高酶活力回收率，且RSD值为0.43%＜5.00%，由此可知，该方案具有一定的可靠性。

表5 交联法固定漆酶正交试验方案和结果表

表6方差分析结果显示，固定时间对酶活力回收率最为关键，其他因素在此试验范围内没有显著差异，对测定结果的影响较小，与直观分析结果一致。

表6 交联法方差分析表

3 结论

（1）通过试验结果可以确定温度、包埋剂浓度（本试验为海藻酸钠）、氯化钙溶液浓度、戊二醛质量分数、交联时间和固定时间均对固定化漆酶的活力有不同的影响。

（2）正交试验优化海藻酸钠包埋漆酶的最佳工艺条件为温度55 ℃、海藻酸钠质量分数3%、氯化钙浓度为0.4 mol·L-1，最优条件下的漆酶活力回收率的平均值为88.3%。

（3）正交试验优化戊二醛交联漆酶的最佳工艺条件为戊二醛质量分数5%、交联时间4 h、固定时间4.5 h，且最优条件下的漆酶活力回收率的平均值为82.2%。

（4）本研究采用两种方法对漆酶固定化工艺进行优化，所采用仪器简单、操作方便，可以为漆酶的固定化工艺研究提供一定的参考依据。