NLRP3炎性小体在急性非ST段抬高心肌梗死中的作用及其与血栓积分的关系

李继忠， 李 曼， 魏鸾颍

非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)是一种不伴ST段抬高的心脏病变，在临床上有较高发病率，且发病率呈逐年攀升态势，给老年人群生存质量带来严重威胁。因此，如何在早期有效、快速地做出诊断，以及寻找NSTEMI的治疗新靶点，是目前临床的重点研究课题。研究[1]指出，冠脉血栓是心血管事件发生的主要原因，严重血栓负荷者采用经皮冠状动脉介入(PCI)手术治疗时易出现血栓事件，影响治疗安全性。目前临床对于血栓事件的发生机制尚未完全明确，通常认为其可能与毛细血管床损伤、局部炎症反应等因素相关[2-3]。研究[4-6]发现，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3)炎性小体活化在介导动脉粥样硬化发生的炎性机制中发挥了重要作用，但尚无研究涉及NLRP3炎性小体与血栓负荷的相关性。本研究收集30例急性NSTEMI患者的临床资料，将其与ST段抬高心肌梗死患者、健康受试者的临床检测指标进行比较分析，并探讨NLRP3炎性小体与血栓积分的关系，以期为急性NSTEMI的早期诊断与靶向治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取河北中石油中心医院2021年1月至2021年5月收治的急性心肌梗死患者60例，按心电图ST段是否抬高分为非ST段抬高组(30例)与ST段抬高组(30例)，并选择30例无心肌梗死的志愿者为健康对照组。

1.2纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 (1)以下3条诊断标准至少符合2条：①有缺血性胸痛的临床病史；②心电图动态演变，伴或不伴ST段抬高；③血清肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白等心肌标志物浓度升高；(2)年龄在18周岁及以上；(3)意识清楚，能够理解诊疗过程，配合完成相关检查；(4)本课题纳入患者知情同意，研究经廊坊市人民医院伦理委员会批准(批准文号：KYLL-2018-22)。

1.2.2 排除标准 ①不符合心肌梗死的临床诊断标准；②资料不全，配合度不佳；③近期有大手术史、炎症性病变史；④合并其他严重恶性病变；⑤急诊PCI术后因病情危重即刻转院或死亡，或术后12 h内出院而无法留取术后标本。

1.3检查方法

1.3.1 实验室检测指标 各组受试者入院后均采集外周静脉血20 mL，采用全自动生化分析仪、化学发光仪、荧光免疫定量分仪器等，进行常规血、肝肾、心肌酶等各项指标检测。

1.3.2 NLRP3炎性小体检测 各组抽取外周静脉血于EDTA管，离心，分离外周血单抗细胞(PBMCs)。分离后的PBMCs中加入1 mL的Trizol混匀备用。

1.3.2.1 Real-time PCR法进行PBMCs NLRP3 mRNA炎性小体水平检测 提取各组PBMCs总蛋白并测定其浓度，再逆转录为cDNA，根据PCR试剂盒说明书扩增引物。NLRP3上游引物序列为：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′：下游引物序列为：5′-GCTTCAGTCCCAGCTCTTCCAC-3′；内参GAPDH上游引物序列为：5′-AGA-CAGCCGCATCTTCTTGT-3′；下游引物序列为：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。建立PCR反应体系，反应条件为预变性，以2-△△ct计算外周血单核细胞NLRP3 mRNA相对表达量。

1.3.2.2 Western blot法进行NLRP3炎性小体蛋白表达检测 提取PBMCs总蛋白进行浓度测定，再依次进行电泳分离、覆膜、封闭、孵育等操作后，应用凝胶成像系统检测其蛋白表达水平。

1.3.3 血栓负荷评估 心肌梗死患者实施冠脉造影，常规行多体位投照，充分显示冠状动脉狭窄情况，管腔狭窄程度在50%及以上即为阳性，反之则为阴性。详细记录两组患者造影所示管腔狭窄部位、程度、类型等，并根据冠脉造影结果计算血栓积分用以评价血栓负荷，采用0～4分5级评分制，未见血栓以0分表示，依此类推，若见大于血管内径2倍的血栓以4分表示，血栓积分越高意味着患者血栓负荷越重[7]。

2 结果

2.1基本资料 三组性别、年龄等常规资料比较差异无统计学意义(P>0.05)；非ST段抬高组射血分数、白细胞计数(WBC)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、N末端B型脑利钠肽(NT-proBNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、高敏C-反应蛋白(hs-CRP)表达及血栓积分均明显高于健康对照组(P<0.05)，但NT-proBNP、cTnI、hs-CRP表达及血栓积分均明显低于ST段抬高组(P<0.05)。见表1。

表1 三组间基本资料比较

2.2炎性因子 非ST段抬高组外周血单核细胞NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表达水平以及IL-1β、IL-18表达均高于健康对照组(P<0.05)，但各指标又低于ST段抬高组(P<0.05)。见表2。

表2 三组间炎性因子比较

2.3冠状动脉造影结果 非ST段抬高组共检出74支动脉狭窄，ST段抬高组共检出68支动脉狭窄，组间在病变部位、病变支数比较差异无统计学意义(P>0.05)；但非ST段抬高组三支病变发生率高于ST段抬高组，且非ST段抬高组管腔狭窄程度>90%、侧支循环率明显高于ST段抬高组(P<0.05)。见表3。

表3 ST段抬高组和非ST段抬高组急性心肌梗死患者冠状动脉造影结果比较(n=30)

2.4血栓负荷与炎性指标 按血栓积分评估结果将非ST段抬高组患者分为高血栓负荷组和低血栓负荷组。高血栓负荷组NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白及IL-18均明显高于低血栓负荷组(P<0.05)。见表4。

表4 不同血栓负荷的心肌心肌梗死患者炎性指标比较

2.5相关性与ROC曲线分析 Pearson相关性分析显示，NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白与血栓积分均呈明显正相关性(r=0.669、0.597，P均<0.05)。ROC曲线分析NLRP3炎性小体对非ST段抬高心肌梗死血栓负荷的诊断价值显示，NLRP3 mRNA的曲线下面积(AUC)为0.78，NLRP3蛋白的AUC为0.72。见图1、表5。

注：NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3

表5 NLRP3炎性小体预测非ST段抬高心肌梗死血栓负荷的ROC曲线分析

3 讨论

心肌梗死是急诊常见病，根据心电图特征一般分为伴或不伴ST段抬高，本研究主要对急性NSTEMI进行分析。NSTEMI后冠脉粥样硬化斑块破裂，且会发生局部血栓或冠脉血管痉挛，出现突发的胸痛，长时间难以缓解。在心电图上，患者大多可见急性心肌缺血，同时伴心肌酶标志物浓度增高。再者，由于罪犯血管中有多种炎性细胞的参与，该病也被认为是一种与炎性反应密切相关的病变[8-9]。在病理机制方面，虽然非ST段抬高与ST段抬高心肌梗死存在诸多共同点，但两者的血栓性质并不完全相同。以血小板血栓为主的是非ST段抬高心肌梗死，血管堵塞后也有可能自发性再通，但其存在更为严重的心内膜损伤[10]；而ST段抬高心肌梗死患者的血栓形成主要为纤维蛋白性血栓，堵塞部位比较固定，易使心肌发生透壁性损伤[11]。

本研究结果显示，非ST段抬高组的射血分数、WBC、CK-MB、NT-proBNP、cTnI血栓积分明显高于健康组，这与吴铮等[12]的研究结果基本相符。CK-MB、NT-proBNP等是心肌功能评估的重要指标，cTnI是心肌损伤的特异性诊断指标，均对诊断与评估急性心肌梗死预后有重要意义。血栓积分可用于评估患者的血栓负荷，为临床科学治疗提供依据。上述指标非ST段抬高组又低于ST段抬高组，提示以上指标可作为急性心肌梗死患者诊断与预后评估的重要指标，以及非ST段抬高与ST段抬高心肌梗死鉴别的依据[13]。此外，炎性因素对心脏病变也有着重要的影响[14-15]。hs-CRP、IL-1β、IL-18作为炎性标志物，在急性感染性疾病诊断中的应用广泛，是急性心肌梗死的重要预测因子。NLRP3炎性小体属于心肌炎症的关系介质，在健康人群中，NLRP3炎性小体活性始终处于抑制状态，当出现炎症性病变便会激活其活性，使NLRP3炎性小体水平升高[16-17]。

在NSTEMI患者中，NLRP3炎性小体可能是通过如下三种机制被激活的：①线粒体中活性氧(ROS)的大量释放；②溶酶体外大量蛋白酶的释放；③胞外三磷酸腺苷(ATP)与依赖ATP的嘌呤受体P2X7受体相结合后，导致通道蛋白Pannexin-1开放，胞内钾离子水平下降，激动剂进入胞内[18-19]。以上机制还有可能通过协同作用，进一步加速NLRP3炎性小体的激活，并使下游IL-1β与IL-18激活，导致机体炎症反应。本研究显示，非ST段抬高组NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白和IL-1β、IL-18均高于健康对照组，但同时各指标表达又低于ST段抬高组，这与韩玉泽等[20]有关心肌梗死大鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β及TNF-α等炎性因子表达水平升高的研究有相似之处。这提示上述炎性因子指标联合心电图检查可以对NSTEMI进行诊断和预后判断，并可作为与ST段抬高心肌梗死鉴别的重要标志物。

冠脉造影结果分析，非ST段抬高心肌梗死患者中，高血栓负荷亚组(血栓积分≥2分)的NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白及IL-18表达均明显高于低血栓负荷亚组(血栓积分<2分)。Pearson分析也发现，非ST段抬高组NLRP3炎性小体mRNA、NLRP3蛋白与血栓积分呈明显正相关性，提示NLRP3炎性小体通路介导的炎症反应与患者血栓负荷存在关联。孟利民等[21]研究显示，高血栓负荷的急性ST段抬高心肌梗死患者炎症因子水平明显高于低血栓负荷组。但目前尚未看到更多有关NSTEMI患者血栓负荷与NLRP3炎性小体等指标相关性的分析。本研究ROC曲线分析结果显示，NLRP3 mRNA与NLRP3蛋白判断血栓负荷的AUC分别为0.78与0.72。提示对NSTEMI患者而言，可以考虑将NLRP3炎性小体表达作为判断血栓负荷的指标之一；同时，也可尝试将NLRP3炎性小体的靶向干预作为新的治疗思路，通过降低患者炎症反应来改善血栓负荷，缓解心肌梗死。但鉴于目前临床尚无更多NLRP3炎性小体在非ST段抬高心肌梗死中的作用及其与血栓积分关系的研究，后续还需更多的实践资料对本研究观点加以验证。

总而言之，NLRP3炎性小体表达与急性NSTEMI患者血栓积分之间存在相关性，其对患者炎症状态及血栓负荷的评估有一定指导意义，对探索心肌梗死的靶向治疗也有一定参考价值。