不同发酵菌种处理对中草药酵素品质及抑菌效果的影响

刘敏杰 ， 邱 婷 ， 陈 琼 ， 汪金萍

(信阳农林学院制药工程学院 ， 河南 信阳 464000)

酵素(Ferment)多以植物为原料，添加适当辅料，在一定条件下经微生物发酵制得[1]。通过发酵可以将大分子有效物质降解成易于机体直接吸收的小分子物质[2]。大量研究表明，酵素具有抗氧化[3]、增强机体免疫[4]、改善便秘[5]、抑制致病菌生长[6]、缓解酒精性肝损伤[7]等功效。中草药发酵是传统中药炮制的一种方法，微生物酿酒、酿醋、制曲等都是靠发酵制得，经过发酵可以增强药效，减弱或消除药物毒副作用、扩大适应症，同时，中草药与益生菌联合使用，可综合药材本身的药用价值和益生菌的功效[8]。

金银花(Honeysuckle)为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或一种管状带初开的花，其味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热的功效[9-10]。蒲公英(Dandelion)为菊科植物蒲公英、碱地蒲公英或同属数种植物的干燥全草，其味苦、甘，性寒，具有清热解毒、利尿通淋、消肿散结的作用[11-12]。野菊花(Wild chrysanthemum)为菊科植物野菊的干燥头状花序，其味苦、辛，性微寒，主要功能为清热解毒、泻火平肝[13-14]。金银花、蒲公英、野菊花都是我国传统中药材，三者资源丰富，既有药用价值也具食疗价值，是近年来医药、饲料、食品开发利用研究的重要品种[15-17]。目前，金银花、蒲公英、野菊花的研究以提取工艺优化和提取物有效成分含量测定为主，而相关金银花、蒲公英、野菊花酵素产品尚且不多。本试验以草本药材金银花、蒲公英、野菊花为原料，添加乳酸菌(Lactic acid bacteria)、酵母菌(Yeast)、乳酸菌和酵母菌混菌发酵制备酵素，通过感官评价和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)清除率考查所得酵素产品品质，并选用大肠埃希菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、沙门菌(Salmonella)3种常见致病菌作为受试菌检测酵素产品的抑菌效果。本试验旨在揭示不同的发酵菌种处理对金银花、蒲公英、野菊花3种中草药酵素品质及抑菌效果的影响，确定最佳的发酵菌种用于开发高品质的酵素产品，同时为金银花、蒲公英、野菊花的合理开发利用提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 信阳产中草药金银花、蒲公英、野菊花，均购自信阳美锐大药房；乳酸菌菌种，购自北京川秀国际贸易有限公司；酵母菌菌种，购自安琪酵母股份有限公司；大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌，均由信阳农林学院微生物实验室提供；营养琼脂，购自上海博微生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏粉，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；白砂糖，购自云南滇鹏糖业有限公司；DPPH自由基、ABTS+，均购自安徽酷尔生物工程有限公司。

1.2 主要仪器 SW-CJ-2FD实用型双人单面垂直净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；XFH-75CA型电热压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司产品；RE52CS型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；Tu-1900紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 酵素的制备 A组为自然发酵，分别称取蒲公英、金银花、野菊花各5.0 g，切段后混匀，置于发酵瓶中，再添加15.0 g白砂糖、120 mL蒸馏水并密封，将发酵瓶置于65 ℃水浴中30 min进行巴氏消毒；B组在A组基础上于无菌条件下添加0.1 g乳酸菌；C组在A组基础上于无菌条件下添加0.1 g酵母菌；D组在A组基础上于无菌条件下先添加0.05 g酵母菌发酵4 d，再添加0.05 g乳酸菌。将4个组的发酵瓶于37 ℃进行恒温培养，每24 h晃动1次，每5 d测1次pH，发酵15 d得到酵素产品。将4个组的酵素产品用2层无菌纱布过滤，于50 ℃旋转蒸发浓缩至浸膏状，再用无菌水稀释至1.0 g/mL，0.45 μm滤膜过滤后密封于无菌试剂瓶内，保存于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 酵素感官评价指标 发酵成熟后的酵素产品色泽偏棕红色且通透，质地均匀无沉淀，有原材料的清香，酸味纯正[18]。邀请10名食品科学专业人员对酵素的色泽(25分)、状态(25分)、气味(25分)和口感(25分)进行评分，具体评分标准见表1。

表1 感官评价标准

1.3.3 酵素产品pH测定 根据GB10468—1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》进行pH测定[19]。

1.3.4 DPPH自由基清除率的测定[20]用无水乙醇配制2.0 mg/mL的DPPH溶液备用，取1.0 g/mL的酵素稀释液2.0 mL，加入2.0 mL配制好的DPPH溶液于试管中，充分摇匀后室温静置20 min，于517 nm测吸光值，计算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率/%=

[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：A0为样品空白对照组吸光值；A1为样品吸光值；A2为同体积的酵素原液和无水乙醇混匀后的吸光值。

1.3.5 ABTS+清除率的测定[21]用2.45 mmol/L过硫酸钾配制7.0 mmol/L ABTS+储备液，暗处静置12 h。用10.0 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)稀释至ABTS+储备液在734 nm下吸光值为0.70±0.02,得到ABTS+测试液。吸取1.0 g/mL的酵素稀释液0.2 mL，加3.8 mL ABTS+测试液，充分摇匀后室温静置5 min，于734 nm测吸光值，计算ABTS+清除率。

随着我国科学技术的快速发展与科技普及程度的提高，人们住房要求明显提高，但是，在建筑工程设计过程中普遍存在不足，例如：建筑结构设计没有将当地位置环境、气候因素考虑进去等。在建筑工程施工建设中普遍存在这样的一个现象，建筑非常重视自身的排水系统的建设，但是当地气候干旱少雨，这就导致能源浪费，究其原因主要是不合实际造成的盲建，增加建筑工程的资金成本投入，同时也大大增加用户购房时所需的费用。因此，在建筑工程结构设计过程中，需要与当地的地质条件与气候条件相结合，以保证建筑工程的经济性。

ABTS+清除率/%=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100%

式中：Ao为同体积蒸馏水加3.8 mL的ABTS+测试液的吸光值；Ai为样品吸光值；Aj为同体积酵素稀释液加3.8 mL蒸馏水的吸光值。

1.3.6 菌悬液的制备 精确称取蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，氯化钠5.0 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，加热溶解分装到试管中，121 ℃灭菌30 min备用。在无菌条件下，取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌各一菌环接种于培养基试管，37 ℃恒温培养24 h，用无菌水调整菌悬液浓度106～107CFU/mL。

1.3.7 抑菌效果测定 精确称取营养琼脂粉33.0 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，加热溶解，121 ℃灭菌30 min，冷却至60 ℃左右时，在无菌条件下倒入培养皿内，每个培养皿倾注20.0 mL左右，待培养基冷却凝固后，用移液枪吸取50.0 μL测试菌悬液滴加到平板上并涂布均匀。用灭菌后的直径6.0 mm吸管在涂布有测试菌的平板上均匀打孔，打孔后的平板底部过火密封，在孔内分别注入100.0 μL的4个组的酵素稀释液，37 ℃恒温培养。24 h后观察菌落生长情况以及是否产生抑菌圈，按抑菌圈直径的大小判定敏感度的高低，抑菌圈直径大于20.0 mm为极敏，15～20 mm为高敏，10～14 mm为中敏，10 mm以下为低敏，无抑菌圈为不敏[22]。

1.3.8 数据处理 所有试验均进行3次重复，结果表示为平均值±标准差，采用SPSS 19.0统计软件对结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 不同发酵菌处理对酵素感官评价的影响 根据1.3.2 酵素感官评价指标对4个组酵素的色泽、状态、气味和口感进行感官评价，结果见表2。由表2可知，4个组酵素产品评分由高到低依次为乳酸菌发酵B组>酵母菌发酵C组>酵母菌和乳酸菌混菌发酵D组>自然发酵A组。其中A组产品呈酱紫红色，昏沉，质地不均匀，酸中带涩，总体评分不高；B组产品呈棕红色、鲜亮，质地均匀，有淡淡的酸甜味，口感润滑且后味香醇，感官评分最高，达88分；C组和D组产品均呈暗红色，比较混暗且都略有分层，C组气味为酸腐味，而D组则为酸臭味，且D组酸苦味明显。

表2 不同发酵菌处理对酵素感官评价的影响

2.2 pH检测 发酵液pH是一项重点检测的参数，相关资料显示，pH对菌体的生长繁殖和代谢产物的积累影响很大，发酵制备的酵素pH<4.0更利于酵素发挥自身的功能[23]。4个组酵素每5 d测1次pH，结果见表3。由表3可知，B组和C组的pH均低于4.0；与发酵1 d比，4个组酵素经过15 d的发酵pH都显著降低(P<0.05)，其中自然发酵A组pH下降了35.86%，乳酸菌发酵B组下降了56.57%，酵母菌发酵C组下降了45.07%，混菌发酵D组下降了34.95%。

表3 4组酵素的pH

图1 4组酵素对DPPH自由基和ABTS+清除率的影响

2.4 抑菌效果 致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌是3种常见病原菌，其对4个组酵素稀释液的敏感性结果如图2所示，3种受试菌对4个组酵素产品均表现出不同程度的敏感性，且能看出添加发酵菌的3个组抑菌圈直径均大于自然发酵组。利用游标卡尺测量抑菌圈直径，结果如表4所示，与A组抑菌圈直径相比，对于大肠埃希菌：B组、C组和D组抑菌圈直径介于24～31 mm，呈现极敏感性，抑菌效果显著，抑菌圈直径分别提高了65.84%(P<0.05)、34.76%(P<0.05)和43.16%(P<0.05)；对于金黄色葡萄球菌：B组抑菌圈直径为(20.09±1.88)mm，呈现极敏感性，抑菌圈直径提高了92.80%(P<0.05)，C组和D组表现为中敏，分别提高了3.93%(P>0.05)和7.87%(P>0.05)；对于沙门菌：B组抑菌圈直径为(20.04±2.02)mm，呈现极敏感性，抑菌圈直径提高了148.94%(P<0.05)，C组和D组表现为中敏，分别提高了26.09%(P<0.05)和37.76%(P<0.05)。

图2 4组酵素的抑菌效果

表4 抑菌圈直径

3 讨论

采用人工接种优势菌种既能保证酵素产品质量，又能增加有效成分含量，阙斐等[25]在香蕉酵素发酵过程中发现人工接种酵母菌或植物乳杆菌的发酵产品品质优于自然发酵产品。乳酸菌和酵母菌是酵素生产与酿酒中重要的两类发酵微生物，在发酵过程中，乳酸菌主要进行乳酸发酵，能产生各种维生素和氨基酸，提高酚类物质的生物利用率，酵母菌则主要进行酒精发酵，并合成多种风味物质[26]。本试验通过添加单一菌种和混合菌种发酵制备金银花、蒲公英、野菊花中草药酵素，并比较所制备的4个组酵素产品品质和抑菌效果，试验结果显示：添加菌种发酵产品较自然发酵结果好；单一菌种发酵产品较混菌发酵结果好；乳酸菌发酵产品较酵母菌发酵结果好；大肠埃希菌对4个组酵素产品表现出高敏感性和极敏感性，金黄色葡萄球菌和沙门菌只对乳酸菌发酵酵素表现出极敏感性；采用乳酸菌发酵制备出来的中草药酵素产品品质最好，其呈棕红色、鲜亮，有淡淡的酸甜味，口感润滑且后味香醇，与自然发酵产品比，对DPPH自由基、ABTS+清除率分别提高了36.74%、34.02%，差异显著(P< 0.05)；对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌的抑菌圈直径分别提高了65.84%、92.80% 和148.94%，差异显著(P<0.05)。本试验结果表明，采用自然发酵、乳酸菌发酵、酵母菌发酵、乳酸菌和酵母菌混菌发酵4种方法，于37 ℃发酵15 d制备的金银花、蒲公英、野菊花中草药酵素中添加0.1 g乳酸菌发酵产品的品质最好，且金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌对1.0 g/mL的乳酸发酵酵素稀释液表现出极度敏感性，这也表明乳酸菌菌种为金银花、蒲公英、野菊花中草药酵素发酵的优选菌种。