基于代谢组学技术探讨水合氯醛致大鼠血生化变化的机制研究*

胡艳辉 陈敏健 周 昆 秦 珩 环 飞 章 婉 张静姝 王玉邦

1 南京医科大学附属逸夫医院，江苏省南京市 211100； 2 南京医科大学公共卫生学院卫生毒理学系；3 南京医科大学公共卫生学院全球健康中心； 4 南京医科大学公共卫生学院流行病学系； 5 江苏省医药农药兽药安全性评价中心

水合三氯乙醛(水合氯醛)是乙醇氯化合成的一种化学物，它主要作为一种麻醉药、催眠药和抗惊厥药用于动物实验研究和临床用药中。虽然此种药物并未得到美国FDA和欧盟的认证，且存在一定的临床风险，但是依然具有一定的市场。 其使用范围主要包括：实验动物(大鼠、小鼠等)、成人、儿童等，由此可见水合氯醛的使用范围相当广泛。水合氯醛作为常规麻醉药在动物实验中经常被使用，会引起一些生化指标的变化，这些生化指标改变与其对人类健康以及对动物实验学结果的科学性具有重要意义。而其背后的机制尚不清楚，局限了对水合氯醛不良效应的评估、预防和治疗措施的制定。

代谢组学是比基因组学、转录组学和蛋白组学更接近表型的一门新兴组学。目前的研究数量虽然少于其他组学，但是它的发展很快。代谢组学主要对生物体内的所有代谢物进行定量分析，研究的对象主要是相对分子质量<1 000的小分子物质。这些内源性小分子代谢物主要涉及以下代谢途径：能量代谢、糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢、辅酶代谢、核酸代谢等。近年来，代谢组学已经被用于从代谢组学角度探索化学物毒性和疾病发生，这也提示代谢组学研究适合用于水合氯醛潜在毒性效应的研究。

肝脏为机体整体代谢的关键脏器；血液反映机体的整体循环代谢状态；胰腺与生化的血糖指标关系密切。本研究采用代谢组学的技术整合动物模型来探讨水合氯醛麻醉药使用对机体血生化的影响，并采用高度相关的代谢组学技术分析肝脏、血清胰腺探讨分子机制，为其不良效应的评估、预防和治疗措施的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄SD雄性大鼠27只，体重200～300g，由上海西普尔—必凯实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2013-0016，动物饲养于南京医科大学卫生分析检测中心屏障系统[实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2015-0009]，温度20～26℃，湿度40%～70%。按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 主要仪器与试剂 UPLC Ultimate 3000 system(Dionex)超高效液相色谱仪、Q-Exactive三重四极杆串联质谱仪、日立7100型全自动血生化仪器、TraceFinder 3.1软件(Thermo Fisher Scientific)、电子天平(MettlerAE240型、T1000型)、KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、XW-80A漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)、离心浓缩干燥仪(Labconco，USA)等。

水合氯醛(中国药品生物制品检定所，批号:100121-199903)、生理盐水(安徽双鹤药业有限责任公司)、胰高血糖素试剂盒(北京北方生物技术研究所)、胰岛素试剂盒(北京北方生物技术研究所)、甲醇、乙腈(≥99.9%，Merck，German)、甲酸(≥98.0%，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、超纯水(PURELAB Ultra纯水仪，英国ELGA公司)等。

1.3 方法 7周龄雄性SD大鼠 27 只，置于代谢笼饲养，适应性喂养1周后，随机分为溶剂对照组、5%水合氯醛腹腔注射组、10%水合氯醛腹腔注射组，每组9只。溶剂对照组大鼠采用颈椎脱臼方式直接进行腹主动脉采血，5%水合氯醛腹腔注射麻醉10min后进行腹主动脉采血，10%水合氯醛腹腔注射麻醉5min后进行腹主动脉采血。采血前禁食16h。全自动血生化仪器检测血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、血糖、甘油三酯、总蛋白、白蛋白、尿素氮的变化。胰高血糖素和胰岛素试剂盒检测胰高血糖素和胰岛素的水平。UPLC-QE代谢组分析平台检测血清、胰腺、肝脏代谢谱的变化。

1.4 代谢组学分析

1.4.1 血清前处理。取血清10μl，按甲醇相∶水相=3∶1沉淀蛋白，涡旋30s，冷冻离心机中4℃16 000g离心15min，将上清液转移至1.5ml进口EP管，并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪(Labconco，USA)中浓缩至干，复溶，待分析。

1.4.2 肝脏、胰腺组织前处理。取组织50mg加入750μl超纯水进行稀释，然后用解剖用剪刀剪碎进行超声匀浆(功率=30%，每超声3s间隔1s，EP管置于冰上)，取混合液150μl，按甲醇相∶水相=3∶1沉淀蛋白，冷冻离心机中4℃ 20 000g 离心15min，将上清液转移至1.5ml进口EP管，并将上清液在室温条件下于离心浓缩干燥仪(Labconco，USA)中浓缩至干，复溶，待分析。

1.4.3 超高效液相色谱串联质谱分析。(1)色谱条件：采用 Hypersil GOLD C18色谱柱 (100mm×2.1mm，粒径1.9μm Thermo Scientific，Germany)，流动相A乙腈(含0.1%甲酸)，流动相B超纯水(含0.1%甲酸)，流速0.40ml/min。采用梯度洗脱的方式，柱温：40℃，进样量：5μl，流动相梯度变化为：0.00～3.00min范围，流动相A为1.0%；3.00～10.00min范围，流动相A为1.0%～99.0%；10.00～13.00min范围，流动相A为99.0%～99.0%；13.00～13.10min范围，流动相A为99.0%～1.0%；13.10～15.00min范围，流动相A为1.0%。(2)质谱条件：代谢物标准品库建立和样本实际检测之前，分别采用正负离子校正液对质谱仪质量数进行24h内定期校正。采用加热电喷雾电离方式(HESI)，正负离子模式喷雾电压分别为3.5kV和2.5kV，两种模式下加热器温度为425℃，毛细管温度为250℃，辅助气气流为13AU，鞘气气流为50AU，反吹气气流为0AU，透镜电压为60V。采用全扫模式进行扫描，扫描范围：70～1 050m/z，分辨率为70 000。

1.5 物质定性分析 采用TraceFinder 3.1软件(Thermo Fisher Scientific)，对代谢物进行定性，以相对定量进行统计分析。

2 结果

2.1 5%、10%水合氯醛腹腔注射后血清生化指标、胰高血糖素和胰岛素的变化 如表1所示，与对照组比较，5%、10%水合氯醛腹腔注射后血糖水平呈现明显上升；胆固醇、甘油三酯、总蛋白、白蛋白、谷草转氨酶水平呈现不同程度的下降；尿素氮、谷丙转氨酶和肌酐水平并未发生变化；胰高血糖素和胰岛素水平也未发生变化。

表1 不同浓度水合氯醛腹腔注射后对SD大鼠血生化指标、胰高血糖素和胰岛素的影响

2.2 血清代谢谱变化 共检测到123个血液代谢物，删除检出率<15%的化学物后，最终留下96个代谢物进行分析。对所有QC样本分析后发现，所有化学物的RSD均<30%，说明分析具有较好的稳定性和可靠性。这些化学物17个分布在氨基酸代谢，16个分布在脂质代谢，12个分布在碳水化合物代谢，10个分布在核酸代谢，7个分布在维生素和辅酶代谢，1个分布在内分泌代谢，3个分布在其他氨基酸代谢，2个分布在外来物质的降解和代谢，2个分布在消化系统代谢，26个分布在其他代谢(图1)。

图1 血清样本筛选的代谢物所在代谢通路分布图

2.3 肝脏代谢谱变化 共检测到183个肝脏代谢物，删除检出率<15%的化学物后，最终留下133个代谢差异物进行分析。对所有QC样本分析后发现，所有化学物的RSD均<30%，说明分析具有较好的稳定性和可靠性。这些化学物27个分布在氨基酸代谢，19个分布在脂质代谢，15个分布在碳水化合物代谢，16个分布在核酸代谢，13个分布在维生素和辅酶代谢，1个分布在内分泌代谢，4个分布在其他氨基酸代谢，2个分布在外来物质的降解和代谢，2个分布在消化系统代谢，1个分布在运输和代谢，33个分布在其他代谢(图2)。

图2 肝脏样本筛选的代谢物所在代谢通路分布图

2.4 胰腺代谢谱变化 共检测到157个胰腺代谢物，删除检出率<15%的化学物后，最终留下129个代谢物进行分析。对所有QC样本分析后发现，所有化学物的RSD均<30%，说明分析具有较好的稳定性和可靠性。这些化学物27个分布在氨基酸代谢，18个分布在脂质代谢，14个分布在碳水化合物代谢，16个分布在核酸代谢，9个分布在维生素和辅酶代谢，1个分布在内分泌代谢，3个分布在其他氨基酸代谢，4个分布在外来物质的降解和代谢，1个分布在运输和代谢，2个分布在消化系统代谢，34个分布在其他代谢(图3)。

图3 胰腺样本筛选的代谢物所在代谢通路分布图

2.5 通过代谢组学方法检测SD大鼠血清和胰腺两种样本结果 与对照组比较，10%水合氯醛腹腔注射后血清代谢差异物共筛选出42种，均呈现明显下降趋势；胰腺样本代谢差异物共筛选出20种，均呈现明显下降趋势。因此，可以得出10%水合氯醛对SD大鼠腹腔注射后，会导致大鼠机体代谢发生紊乱(表2)，提示动物实验中采用水合氯醛作为麻醉剂应慎重考虑。

表2 血清和胰腺样本筛选的代谢差异物

2.6 肝脏样本筛选出1种代谢差异物 10%水合氯醛组与对照组比较，结果显示2-羟基棕榈酸上升2.48倍，具有统计学差异(P=0.035)。

2.7 血清、肝脏、胰腺多样本的关键代谢物通路汇总图 将上述差异代谢物用KEGG号注释，然后基于KEGG通路绘制网络图(https://www.kegg.jp/)，见图4。代谢网络显示共有3条代谢通路在水合氯醛作用下发生改变分别为：三羧酸循环代谢通路、脂质代谢通路(含胆固醇代谢)、氨基酸代谢通路(含谷胱甘肽代谢)；在水合氯醛作用下代谢网络通过三羧酸循环为核心，通过联系上游糖酵解途径以及相关的脂质代谢、氨基酸代谢，影响血生化指标。

图4 关键代谢物形成的通路汇总图(血清、肝脏、胰腺样本结果汇总)

3 讨论

水合氯醛作为一种麻醉药，本研究发现腹腔注射后机体血生化指标出现不同程度的异常，这与之前文献报道是一致的[1-2]。然而，其影响机制尚无相关报道。

本研究的生化结果显示水合氯醛导致的生化代谢改变体现在糖(血糖)、脂(胆固醇、甘油三酯)、蛋白质(总蛋白、白蛋白、酶蛋白)相关指标的紊乱，而代谢组学分析发现的代谢网络以三羧酸循环为核心。值得注意的是，有研究指出三羧酸循环为联系糖、脂、氨基酸(蛋白质)代谢的核心，这揭示了水合氯醛导致生化指标紊乱的机制。

本研究的关键生化指标改变为血糖含量上升，这主要与血液中6-磷酸葡萄糖下降有关，提示水合氯醛导致葡萄糖无法有效转化为6-磷酸葡萄糖，而导致血糖的堆积，并且干扰下游三羧酸循环代谢[3-5]。三羧酸循环通路中间代谢物能代谢成氨基酸，氨基酸是合成蛋白质的前体，因此会导致血生化中总蛋白、白蛋白以及酶蛋白含量的变化[6]。三羧酸循环直接影响脂质和胆固醇代谢通路，因此导致了血生化中甘油三酯和胆固醇含量下降。对这些代谢标志物的检测和干预有望实现对水合氯醛毒性的监测和防治。

本研究首次从代谢组学角度阐明了水合氯醛腹腔注射后血生化指标的变化机制，且形成了关键的代谢网络，为今后水合氯醛在动物实验和临床用药的安全性以及毒性的预防和治疗提供了指导依据。