肠道菌群与慢性乙型肝炎发生发展及预后的关系

郭紫薇， 张嘉鑫， 李 硕， 李晓斌， 朱 顺， 靳 茜， 李小科， 叶永安

1 北京中医药大学东直门医院 脾胃病科， 北京 100700； 2 北京中医药大学 第一临床医学院， 北京100029

慢性乙型肝炎(CHB)是一个重要的全球健康问题，缺乏治愈手段，现有标准治疗的效果不理想[1-2]。根据世界卫生组织的报告，全世界约有2.57亿慢性HBV感染者。虽然乙型肝炎疫苗和抗病毒药物的应用已经使得HBV的感染率逐年下降，但对于整个社会以及众多家庭来说仍然是一个沉重的经济负担和健康威胁[3-4]。CHB迁延难愈的核心在于该病的发生发展和结局预后受到宿主免疫、病毒本身与环境等因素的共同作用，其中宿主免疫功能的失能是导致HBV慢性感染持续不能清除的主要原因。值得关注的是，近年有研究发现肠道菌群可能与宿主的免疫功能有关。菌群失调可能出现在CHB的各个阶段，并促进感染的慢性化和病情的进展，而调整肠道菌群的治疗可能有助于改善疾病的预后。本文将从肠道菌群通过肠-肝轴对于肝脏免疫的影响、菌群失调与CHB发生发展的关系，以及不同疾病阶段肠道菌群的变化等方面进行回顾，并综合当前的研究证据探讨调控肠道菌群改善疾病预后的可能性。

1 肠道菌群通过肠-肝轴调控肝脏免疫，影响慢性肝病的发展

1998年Marshall提出了“肠-肝轴”概念，肠-肝轴是胃肠道和肝脏的密切解剖和功能双向相互作用的结果，主要是通过门静脉循环发挥作用[5]。肝脏70%的血液供应来自门静脉，肠道的一系列代谢产物以及环境毒素等通过门静脉回流至肝脏[6]。肠道微生物群是宿主新陈代谢的中央调节器[7]，包括细菌、真菌、古生菌等。目前研究的肠道菌群一般是指肠道细菌，它们与人体之间也存在着特定的共生关系[8]，并在消化多种食物、合成维生素以及分解毒素和药物方面发挥着重要作用[9]。肠道菌群和肝脏是一个由代谢、免疫和神经内分泌介导的复杂网络系统。生理状况下双方维持和谐统一的关系，肠道正常菌群与肠黏膜形成稳定黏膜屏障，使得肠黏膜在选择性吸收肠内营养物质的同时，也阻挡了细菌、毒素等有害物质的通过[10]。

肠道菌群通过肠-肝轴可能直接或间接地影响宿主免疫[11]。一方面，在正常情况下，肠道微生物群与肠上皮细胞和免疫细胞上的Toll样受体(TLR)之间的相互作用有助于维持免疫系统的稳态[12]。当来自细菌等微生物的抗原经由人体激活适应性免疫系统后，包括脂多糖(LPS)、肽聚糖和鞭毛蛋白在内的病原相关分析模式通过肠肝轴易位至肝脏，激活肝细胞表面的TLR4，由此启动肝细胞内的级联信号转导，引起核因子(主要是NFKβ、p38MAPK、JNK等)的活化。此时，大量炎症细胞因子和趋化因子进入门静脉，肝细胞遭受损伤，引起了一系列免疫炎症反应[5]。另一方面，肠道菌群除了通过调节代谢与免疫应答等功能维持与肝脏的动态平衡，还通过参与胆汁酸的代谢介导免疫和炎症反应[13]。胆汁酸由肝脏合成，约95%的胆汁酸会在肠道中被重吸收，通过门静脉循环至肝脏[14]。胆汁酸和肠道微生态之间有着持续的相互调节关系，并能够直接或间接地影响肠道菌群结构和功能[15]。肠腔胆汁酸水平升高与炎症反应密切相关，胆汁酸可以直接作用于上皮细胞，调节促炎细胞因子的产生，如IL-8、IL-1和IL-6[13]。当肠道菌群失调时，肠道内革兰阴性杆菌过度生长繁殖产生大量内毒素，或由于肠壁通透性增加而吸收入门静脉的内毒素增多，如果肝内Kupffer细胞吞噬功能低下，内毒素的量超过了肝脏的清除能力，引发细胞因子级联反应，导致免疫反应失控，引起大量炎症介质释放，将进一步加重肝损伤及病情进展[16]。

2 肠道微生态失调与HBV感染慢性化及病情长期进展有关

HBV的防控有两个关键的临床问题。第一是HBV感染慢性化，这与多种因素如宿主免疫因素和病毒因素相关[17]。第二是即便病毒得到有效控制，依然存在组织学(如肝纤维化和肝硬化)进展[18]。在这两个重要的临床问题上，肠道菌群的失调都是一个不可忽视的重要推动因素。

2.1 肠道菌群失调可能促进HBV感染慢性化 机体免疫应答功能失衡被认为是感染慢性化过程中最重要的因素。健康人体内自然杀伤细胞(NK细胞)数量较CHB患者及HBV携带者高，HBV持续感染与NK细胞数量的减少及其活性降低具有相关性。适应性免疫应答中，如辅助性T淋巴细胞(Th)的缺少导致细胞毒性T淋巴细胞活性降低，HBV未能有效清除而持续慢性感染[19]，而肠道微生物群的结构变化、细菌易位以及由此产生的免疫损伤影响HBV感染的发生和发展[20]。有研究[21]发现，HBV感染者菌群结构发生了改变，如双歧杆菌、罗菌属及类杆菌等益生菌数量显著降低，肠球菌、肠杆科细菌及酵母菌等条件致病菌显著增加。Chou等[22]提出了一个与年龄相关的HBV感染模型，表明肠道微生物的建立能够一定程度上影响肝脏免疫反应，其可能是通过免疫刺激和免疫耐受途径作用于肝脏，影响HBV清除或持续。肠道菌群具有多样性，其中真菌微生物群在某种程度上与疾病进展相关，其可能会增强HBV的感染水平[23]。同时，由于HBV慢性感染，患者免疫功能持续低下，肠道免疫防御系统遭到破坏，肠道菌群结构平衡被打破，念珠菌等肠道定植真菌很可能成为人体黏膜和侵袭性真菌感染的条件致病菌。

2.2 肠道菌群失调可能促进CHB的病情长期进展

CHB、肝硬化、肝细胞癌(HCC)，常被称作HBV感染“三部曲”，即HBV慢性感染长期迁延不愈发生的组织学进展。且有研究[10]发现，肠道菌群的失调是“三部曲”发生发展的催化剂，与TLR通路、炎性小体通路和肠道细菌代谢产物参与其中有关[24]。如TLR通路被激活，启动固有免疫和适应性免疫机制。使活化的淋巴细胞分化为Th1、Th2和Th17，从而增加IL-4、IL-5、IL-12 和IFNγ等的分泌。这些炎症介质激活肝星状细胞，形成肌成纤维细胞，产生胶原蛋白，导致肝纤维化乃至肝硬化[25]。同时，HBV慢性感染还可能与肠道菌群所引发的免疫反应持续时间长或免疫反应过度有关，使体内产生大量的细胞因子加重了肝损伤[20]。因此，肠道菌群失调作为导致宿主免疫功能紊乱的原因之一，将伴随着HBV慢性感染的进展而长期存在[26]，并可能成为HBV感染相关肝病进展的促进因素。

2.2.1 肠道菌群失调可能推动乙型肝炎肝硬化的发展 肝硬化是各种慢性肝病进展而来的结果，肝脏病理学终末期表现为肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖[27]。在我国，引起肝硬化的病因主要以HBV感染为主[28]。HBV感染伴随肠道菌群的失调，而这种改变在使宿主长期处于HBV慢性感染过程的同时，也将进一步加重肝纤维化乃至肝硬化的进展。因此，HBV感染背景下的菌群失调在肝硬化等终末期肝病的进展中尤其值得重视。当肠道菌群失调时，肠道内细菌种属和数量以及肠道真菌菌群分子生态结构均发生改变，一方面由于肝功能下降，合成补体活性低下、各种相关免疫分子作用机制减弱等因素使得机体免疫防疫系统功能下降，另一方面肝硬化患者出现门静脉高压时，肠系膜血流停滞而缺氧，交感神经刺激 、氧化亚氮合成增加等因素使得小肠能动性下降。此时，肠道各种条件致病性真菌加速繁殖，可能引起肝硬化患者肠道真菌感染。进一步提示肠道真菌菌群生态结构改变与乙型肝炎发展历程相关[29]。同时肝硬化使得胆汁酸分泌减少，抑菌作用减弱，机体免疫功能下降，进一步加剧肠道菌群失调。如Lu等[2]发现，随着CHB、肝硬化病情进展，肠道中双歧杆菌科和肠杆菌科(B/E)的比值也逐渐降低，提示肠道内正常菌群对机会致病菌及致病菌定植的抵抗力下降，从而进一步造成肠道菌群失调。Qin等[30]使用宏基因组学方法，揭示了肝硬化患者肠道微生物群的主要变化，提示可能由于肝硬化时，胆汁酸和胃酸分泌均有所减少，口腔细菌对肠道大量侵袭，肠道菌群进一步紊乱，肝硬化进展加快。这与Bajaj等[31]的研究相一致，肝硬化患者的有益菌及定植菌相对丰度降低，其他类菌群相对丰度较高。且有相关研究[32-33]发现，肠道菌群的紊乱程度随着肝功能Child-Pugh分级程度增高而增高。

2.2.2 肠道菌群失调可能促进了HBV感染背景下肝癌的发生 HCC通常发生在慢性损伤的肝组织中，由于持续慢性炎症的过程，导致HCC持续进展。80%的HCC病例与肝硬化或纤维化有关，HBV感染被公认为HCC发生发展的危险因素[34-35]。现有研究认为，肠道菌群可能通过免疫与代谢两种机制与HCC关联。首先，免疫因素方面，肠道菌群及其相关产物作为外界刺激因子可以被机体的免疫系统识别，其免疫过程仍是由LPS-TLR4通路所参与的相关促炎症反应，最终导致肝细胞过度分化，肿瘤免疫遭到抑制，促进肝癌的发展[36]。代谢因素方面，如次级胆汁酸脱氧胆酸是肠道菌群重要的代谢产物，而有研究[37]表明，次级胆汁酸脱氧胆酸在通过门静脉系统进入肝脏后引起肝脏星状细胞向衰老相关的分泌表型转化，从而产生更多的促炎因子和促癌分子，促进肝癌的发生发展。同时，小肠内细菌过度生长导致的菌群种类与数量的变化影响着肝癌的进展。有研究[38]对HCC患者和非HCC患者进行肠道微生物群进行测定，发现HCC患者粪便中的大肠杆菌数量明显多于非HCC患者，一定程度提示大肠杆菌的过度生长伴随着HCC的发生。因此，针对肠道菌群的作用机制研究将有助于为HCC的诊断、治疗及预后分析提供新的靶点和思路。

3 调控肠道菌群可能改善HBV感染的预后

肠道菌群的异常可能是伴随疾病出现，或者是诱发疾病进一步加重的因素。而近几年有研究发现通过肠道菌群的调节，可以在某些疾病的关键环节上提高疗效，尤其是对于HBeAg阴转，目前仍是标准核苷酸类似物疗效不理想的环节。在现阶段的肠道菌群调节中，主要采用的是补充特定菌，如双歧杆菌，或粪便菌群移植的方式。

3.1 补充特定菌种对CHB的作用 双歧杆菌被认为是正常肠道菌群中重要的菌种[39]，双歧杆菌参与了短链脂肪酸的生成，短链脂肪酸有助于减少肠黏膜屏障的损伤，并介导免疫细胞的发育[40]。越来越多的证据表明，在CHB相关肝病患者中，补充双歧杆菌等益生菌是有益的[41]，通过对肠道正常菌群进行调节, 减少来自肠道的内毒素，上调黏膜屏障效应，延缓肝脏疾病的发展进程[42]。朱泽等[43]通过收集CHB患者、CHB联合益生菌治疗患者、健康体检者进行横断面研究，发现CHB联合益生菌治疗患者肠道菌群、外周血、粪便中免疫因子发生改变，益生菌能影响CHB患者肠道菌群的组成，并进一步改变肠道的炎症微环境。有研究[44]也表明，采取益生菌的治疗不仅能够调节CHB患者的肠道菌群，还能进一步改善其肝功能、肝纤维化等指标。王杏雨等[45]随机将130例CHB患者分为对照组、观察组和治疗组，观察组在治疗组基础上加用双歧杆菌四联活菌片，3个月后治疗结果表明观察组患者的双歧杆菌及乳酸杆菌数量高于对照组，肠杆菌、肠球菌数量低于对照组，同时观察组肝功能、肝纤维化指标明显低于对照组。上述研究均表明益生菌治疗在改善CHB患者肠道菌群、肝功能及肝纤维化中具有重要作用，为今后临床中的应用增添了新的思路，拓宽了治疗渠道[46]。益生菌还能够与抗病毒药如恩替卡韦联合治疗，降低CHB患者对抗病毒药的耐药性，可作为一种辅助治疗手段，抑制CHB患者HBV的持续复制。如有研究[47-48]发现恩替卡韦联合双歧杆菌三联活菌在乙型肝炎肝硬化患者的抗病毒及促进肝功能恢复方面有一定疗效，具有较高的应用价值。

3.2 粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation, FMT)治疗CHB的作用 FMT是一种相对简单的治疗方法，它通过将健康的供者微生物群转移到一个现有但受到干扰的微生物生态系统中，从而建立一个新的胃肠道菌群平衡体系[49]。FMT作为一种新的治疗手段，广泛应用于消化系统疾病和其他系统疾病[50]，在难治性肠道感染[51]、神经心理疾病(如自闭症)[52]、自身免疫性疾病[53]等方面被证实具有特定作用。在治疗CHB方面，有相关研究已经提示了FMT可能具有更值得期待的效果。如FMT通过调节次级胆汁酸和短链脂肪酸的代谢和刺激黏膜免疫系统修复肠道屏障[49]，减轻黏膜免疫炎症，改善肠肝循环[54]。一项非随机的初步研究[55]认为FMT还可诱导长期抗病毒治疗的HBeAg阳性CHB患者体内HBeAg的清除，抑制病毒复制，但仍需要随机对照试验来确定FMT在这类患者中的作用[56]。Ren等[57]进行了病例对照研究，并认为FMT似乎是安全的。研究共纳入18例患者，其中5例接受了FMT的患者都出现了不同程度的HBeAg下降，并且3例患者获得了HBeAg清除，而对照组无一获得HBeAg阴转，且在5例FMT治疗患者中未发现继发感染、腹部不适、腹泻或便秘等不良反应。可在一定程度上表明FMT应用耐受性好，并发症少。FMT发挥作用的机制，可能与FMT能够降低IL-18水平、抑制TLR4信号通路有关，可改变肠道菌群结构或增加菌群多样性[58]，但仍需要更多的设计良好的随机对照试验来验证FMT对治疗相关CHB相关肝病的疗效和安全性。此外，还需要考虑包括供体选择和筛选、粪便制备和给药途径的标准化方案、注射数量和注入菌种的数量、受者准备及FMT前后肠道菌群的构成变化和治疗机制等问题[59]。

4 总结与展望

肠道菌群作为一个复杂而又多样化的微生态系统，与宿主免疫之间有着相互协调的关系。近年大量研究均证实，在HBV感染相关性疾病当中，菌群失调可能作为导致感染慢性化和疾病进展的重要因素之一，而对菌群的调节可能是有益于建立宿主对于慢性病毒感染的免疫控制。但由于肠-肝轴的调控作用是双向的，尽管在HBV慢性感染、乙型肝炎肝硬化以及肝癌人群中肠道微生态出现了失衡，但亦需要考虑到，这种失衡是在一个慢性病过程中的现象，并不能直接归纳为肝硬化以及肝癌进展的原因。笔者认为，在终末期肝病过程中，随着肝脏功能的衰竭，胆汁酸代谢发生改变，继发产生了菌群的失调。而菌群失调又是进一步推动肝脏炎症、纤维化、炎-癌转化的原因之一。

菌群测序技术的发展，为通过观测菌群改变预测疾病进展提供了可能。但目前对肠道微生态的理解仍知之甚少。由于目前菌群功能分析的手段尚不成熟，通过宏基因组测序无法完整解释菌群在疾病特定节点上发挥的作用，因此有待开展包括菌群功能分析以及结合多组学(转录组学、蛋白质组学等)的深入研究，为剖析CHB不同阶段菌群失调的功能内涵和现实意义奠定基础。此外，将微生态制剂或FMT技术与常规治疗方案(如抗病毒)联合使用治疗CHB可能是有效的，尽管现有临床研究病例数量不足，研究数据尚不充分，但前景值得期待。菌群调节治疗作为CHB这一难治疾病的潜在终点解决方案，有望在未来通过高级别的循证证据加以确认。考虑到菌群失调广泛存在于HBV感染的各个疾病阶段，并可能作为疾病进展的伴发或二次打击因素，鉴定肠道菌群针对CHB的作用机制或免疫调控途径可能为乙型肝炎的治疗带来新的思路，并将有利于解析现有治疗方案(包括中药治疗)的疗效内涵。在未来，调节肠道菌群可能作为HBV感染相关肝病的重要辅助治疗手段之一，为降低这一系列疾病的社会经济负担提供有效方案。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：郭紫薇、张嘉鑫、李硕负责设计研究，资料分析，撰写论文；郭紫薇、朱顺、李晓斌、靳茜参与检索文献，数据提取，修改论文；李小科、叶永安负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。