结肠癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表达水平及临床意义

陈文霞 刘艳红 肖兴国 张磊 王琳 吴慧丽

(郑州大学附属郑州中心医院消化内科，河南 郑州 450007)

微小RNA(miRNA)是一类非编码单链RNA分子，并可通过与靶基因信使RNA(mRNA)相结合从而调控细胞增殖、分化等过程，研究显示miRNA在结肠癌中异常表达并可能参与结肠癌发生及发展过程〔1～4〕。miR-17-5p在口腔鳞状细胞癌中呈高表达并可作为评估患者术后复发的重要指标〔5〕。miR-25-3p在三阴性乳腺癌中呈高表达，并可作为临床诊断的重要指标〔6〕。但miR-17-5p、miR-25-3p在结肠癌中的表达及其作用机制尚未完全阐明。本研究探讨miR-17-5p、miR-25-3p在结肠癌患者血清中的表达水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年2月至2017年8月郑州大学附属郑州中心医院收治的92例结肠癌患者为研究对象，年龄50～75岁，平均(62.13±12.15)岁，男49例，女43例，患者均经病理证实为结肠癌。根据miR-17-5p、miR-25-3p表达量的平均值将结肠癌患者分为miR-17-5p高表达组(62例)、miR-17-5p低表达组(30例)、miR-25-3p高表达组(58例)、miR-25-3p低表达组(34例)。 排除标准：合并其他恶性肿瘤；肝、肾等重要器官严重受损。选取同期医院健康体检的志愿者92例为对照组，其中男50例，女42例，年龄48～72岁，平均(61.28±10.54)岁。两组受试者年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。抽取两组受试者静脉血5 ml，4℃条件下经12 000 r/min离心10 min，分离血清置于-80℃超低温冰箱保存。

1.2主要试剂 miR-17-5p、miR-25-3p引物由上海生工生物工程股份有限公司；Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司提供；反转录与实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.3实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-17-5p、miR-25-3p的表达水平 采用Trizol法提取血清中的总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。参照反转录试剂盒将总RNA合成cDNA。引物序列为：miR-17-5p正向5′-TGGTGACCAGCTGATCGTAC-3′，反向5′-TCGCATCGACTAGCTACTACG-3′；miR-25-3p正向5′-TTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′，反向5′-TGACTGACTGACGTGACTCC-3′；U6正向5′-ATTGGAACG ATACAGAGAAGATT-3′，反向5′-GGAACGCTTCACG AATTTG-3′。qRT-PCR体系：10×PCR缓冲液2.5 μl，硫酸镁(MgSO4)2.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，无核糖核酸酶双蒸水(RNase-Free ddH2O)补足体系至25 μl；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。miR-17-5p、miR-25-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-17-5p、miR-25-3p相对表达量。

1.4随访 患者均进行3年随访，随访方式为电话或复查，统计患者生存时间及生存率。

1.5统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、χ2检验；受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-17-5p、miR-25-3p对结肠癌的诊断价值；采用Kaplan-Meier对3年生存情况进行分析，Log-Rank法检测组间生存差异；采用COX比例风险回归分析影响结肠癌患者预后的相关因素。

2 结 果

2.1结肠癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表达水平 与对照组比较，结肠癌组血清miR-17-5p、miR-25-3p的表达水平升高，差异均有统计学意义(均P<0.001)，见表1。

表1 结肠癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表达水平比较

2.2miR-17-5p、miR-25-3p与结肠癌患者临床病理参数的相关性 miR-17-5p、miR-25-3p与TNM分期、淋巴结转移、分化程度密切相关(P<0.05)，见表2。

表2 miR-17-5p、miR-25-3p与结肠癌患者临床病理参数的相关性〔n(%)〕

2.3miR-17-5p、miR-25-3p对结肠癌的诊断价值 miR-17-5p诊断的敏感性为78.26%，特异性为76.09%，ROC曲线下面积(AUC)为0.776，95%CI：0.709～0.784；miR-25-3p诊断的敏感性为83.70%，特异性为88.04%，AUC为0.864，95%CI：0.805～0.910，见图1。

图1 ROC曲线分析miR-17-5p、miR-25-3p对结肠癌的诊断价值

2.4miR-17-5p、miR-25-3p与结肠癌患者预后的相关性 miR-17-5p高表达组患者生存率(20.31%)显著低于miR-17-5p低表达组(56.32%)，miR-25-3p高表达组患者生存率(18.35%)显著低于miR-25-3p低表达组(58.62%)，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 miR-17-5p、miR-25-3p与结肠癌患者预后的相关性

2.5影响结肠癌患者预后的相关因素 miR-17-5p、miR-25-3p、淋巴结转移、分化程度是影响结肠癌患者预后的危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响结肠癌患者预后的相关因素

3 讨 论

miRNA可通过调控靶基因表达而调节细胞增殖、迁移及侵袭等，从而参与结肠癌发生及发展过程，既往研究显示miRNA可作为结肠癌诊断及评估患者预后的重要指标〔7～9〕。但仍有部分miRNA在结肠癌发生及发展过程中的作用尚未完全阐明。

miR-17-5p在胰腺癌中呈高表达并可通过促进细胞周期进展从而增强胰腺癌的增殖〔10〕。敲低miR-17-5p表达可通过靶向10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)而抑制甲状腺癌增殖，促进细胞凋亡〔11〕。miR-17-5p通过抑制netrin 4表达从而促进乳腺癌细胞迁移及侵袭〔12〕。研究表明miR-17-5p在膀胱癌患者血清中表达上调，并可作为膀胱癌早期诊断及判断患者预后的重要指标〔13〕。本研究结果显示结肠癌患者血清miR-17-5p的表达水平随着结肠癌TNM分期、淋巴结转移及分化程度的增加而显著升高，提示miR-17-5p可能参与结肠癌发生及发展过程。本研究采用ROC曲线分析miR-17-5p对结肠癌的诊断价值，结果显示miR-17-5p诊断结肠癌的敏感性与特异性较高，提示miR-17-5p对结肠癌具有一定诊断价值。

miR-25-3p通过调节PTEN/蛋白激酶B(Akt)途径而促进视网膜母细胞瘤的恶性表型〔14〕。长链非编码RNA(LncRNA)小核仁RNA宿主基因(SNHG)5通过调控miR-25-3p/B细胞易位基因(BTG)2分子轴而促进子宫内膜癌的进展〔15〕。LncRNAGATA6反义RNA1(GATA6-AS)通过下调miR-25-3p表达从而抑制胃癌细胞的增殖〔16〕。相关报道指出miR-25-3p高表达可促进胰腺癌发生及发展〔17〕。本研究结果显示miR-25-3p在结肠癌患者血清中呈高表达，其表达量与患者TNM分期、淋巴结转移、分化程度密切相关，提示miR-25-3p在结肠癌发生及发展过程中发挥重要调控作用。本研究采用ROC曲线分析miR-25-3p对结肠癌的诊断价值，结果显示miR-25-3p的敏感性与特异性较高，提示miR-25-3p在结肠癌早期诊断中具有一定应用价值。本研究采用COX比例风险模型分析影响结肠癌患者预后的相关因素，结果显示miR-17-5p、miR-25-3p、淋巴结转移、分化程度是影响结肠癌患者预后的危险因素，提示miR-17-5p、miR-25-3p表达量升高预示结肠癌患者预后不良。

综上所述，结肠癌患者血清miR-17-5p、miR-25-3p的表达水平显著升高，二者表达量均与患者临床病理参数密切相关，并可能作为结肠癌诊断及判断患者预后的重要指标。但关于miR-17-5p、miR-25-3p在结肠癌发生及发展过程中的作用机制仍需进行体外细胞实验与体内实验进行验证。