口腔鳞癌组织长链非编码RNA LINC01605表达与临床病理特征关系研究

施 健，胡千慧 ，张雪杰

(1.锦州医科大学附属第二医院，辽宁 锦州121000；2.锦州医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 锦州121012)

口腔鳞癌是头颈部最常见的肿瘤之一，起源于鳞状上皮的恶性转变。鳞癌细胞具有高增殖性，病变具有侵袭性、进展性的特征[1-2]，其发病原因尚不清楚。近年随着分子生物学的发展，学者重点关注基因调控通路异常在肿瘤形成和进展中的作用，并认为多种因子参与肿瘤的进展，也是肿瘤形成的重要因素之一[3]。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是指超过200 bp的单核苷酸序列的统称，近年学者关注到其与肿瘤的形成和进展相关，由于其种类众多，因此现阶段对LncRNA的研究较为局限。LncRNA虽然不具有编码蛋白的功能，但是其可作为多种具有调控因子的下游因子发挥作用，其下游因子包括微小RNA(microRNA,miRNA)及相关靶蛋白等[4]。本研究探讨LncRNA LINC01605(LINC01605)在口腔鳞癌中的表达特征，分析其与增殖相关指标的关系，探讨其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年1月至2018年4月在我院确诊为口腔鳞状细胞癌的患者作为研究对象。病例纳入标准：①均行手术根治性治疗，术后经病理检查确诊，符合WHO的病理诊断标准；②临床随访资料完整。排除标准：①术前行放、化疗者；②伴有较严重的基础性疾病者；③病理形态中具有异源性分化者。共选择58例，其中男30例，女28例，年龄38～83岁，中位年龄59岁，其中高分化21例，中分化27例，低分化10例。留取肿瘤组织和距肿物边缘>3 cm的正常口腔黏膜组织为对照，标本均于术后30 min内完成取材，并立即置于-80℃冰箱中冻存。本研究经医院伦理委员会批准通过，符合《赫尔辛基宣言》中的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 实时荧光定量PCR：基于术后新鲜冻存组织进行检测，应用实时荧光定量PCR(quantitative PCR)法检测LINC01605的表达。应用Trizol(美国Invitrogen公司)提取总RNA，鉴定纯度。反转录法(广州复能基因有限公司)获得cDNA。引物由广州复能基因有限公司合成，LINC01605引物上游：5’-GCTAACACTGGAAGAGAGATCGCT-3’，下游：5’-CTGTGAGTGGGCCGGTGCCAAAC-3’。选择U6作为内参，上游：5’-CTCGTTTACGCAACGTATACACA-3’，下游：5’-AACGGCAGCCGAGGTACGTGT-3’。执行实时PCR(PCR仪为美国伯乐公司生产)，程序设定：95 ℃预变性30 s；变性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共30个循环。结果以2-ΔΔCT表示。

1.2.2 免疫组化实验：应用免疫组化二步法检测肿瘤组织中Ki67的表达，Ki67工作液购自北京中杉金桥生物技术公司。肿瘤组织经中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋后，切取4 μm切片后应用免疫组化二步法进行检测，DAB显色。操作严格按实验步骤完成，设阳性对照(扁桃体组织)，做好质控工作。Ki67的表达部位为细胞核，以棕黄色为阳性，选择3个高倍视野(400倍)计算百分率，取平均值计为增殖指数。

2 结 果

2.1 LINC01605在口腔鳞癌和正常口腔黏膜组织中的表达量比较 LINC01605在口腔鳞癌中的表达量(1.32±0.25)明显高于正常口腔黏膜组织(1.02±0.30)(t=4.31，P=0.010)。

2.2 LINC01605在口腔鳞癌不同临床病理特征分组中的表达比较 LINC01605的表达在不同肿瘤最大径、分化程度及有无脉管癌栓的分组中表达比较差异有统计学意义(均P<0.05)。而在不同性别、年龄、有无吸烟史及有无神经累犯的分组中差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 LINC01605在口腔鳞癌不同临床病理特征分组中的表达比较

2.3 口腔鳞癌组织中LINC01605与Ki67的相关性分析 免疫组化检测到口腔鳞癌中Ki67增殖指数的范围是10%～70%，平均32.58%。应用Pearson相关分析显示LINC01605与Ki67增殖指数具有正相关性(r=0.64，P=0.029)。见图1。

图1 口腔鳞癌组织中LINC01605表达与Ki67的相关性

2.4 口腔鳞癌组织中LINC01605表达与患者生存时间的关系 对患者进行术后3年(36个月)生存时间的随访，随访到患者术后的生存时间为10～36个月，中位生存期26个月，其中失访2例(计为删失值)。应用K-M生存分析显示LINC01605的表达与术后生存时间相关(临界值1.32，χ2=4.24，P=0.040)。即LINC01605高表达患者生存时间较短。见图2。

图2 口腔鳞癌组织中LINC01605表达与患者生存时间的关系

3 讨 论

LncRNA是近年研究的热点。研究显示LncRNA由对应的基因转录形成，具有5’帽子和ploy尾巴，通过剪切形成的成熟体，参与表观遗传学调控、细胞周期调节和细胞分化调控[5-6]。虽然近些年发现在ceRNA机制中LncRNA通过竞争性结合miRNA调控其对应的靶基因，但是相关实验仍然发现LncRNA在肿瘤中可能具有独立地调控生物学功能的作用，尤其是其表达异常时可能预示着某些生物学功能[7-8]。LINC01605是我们在进行生物信息分析时发现的与肿瘤相关的因子，应用qRT-PCR检测后发现LINC01605在口腔鳞癌中表达升高，证实了Gepia中的分析结果，提示LINC01605具有癌基因样的作用，对肿瘤形成有重要的促进作用。本研究结果显示LINC01605在口腔鳞癌不同肿瘤最大径的表达差异有统计学意义，提示LINC01605高表达时肿瘤可能处于快速生长状态，LINC01605与Ki67的相关性，亦证实了LINC01605高表达对肿瘤生长具有的促进作用，但是关于LINC01605是否具有直接调控肿瘤增殖的作用，尚有待基础研究中的细胞学实验，并应用CCK-8等实验进行明确。LINC01605促进肿瘤生长可能是其经典作用，其下游的多种调控因子也具有增殖促进作用。Wang等[9]研究发现LINC01605通过调控miR-493-3p促进鳞癌的增殖、抑制凋亡；Qin等[10]通过高通量测序鉴定LncRNA在肿瘤中的表达差异，发现LINC01605在膀胱癌组织中表达上调。通过PCR法检测膀胱癌和正常尿路上皮组织以及人类膀胱癌细胞系中LINC01605的相对表达水平，并通过CCK-8实验、集落形成实验、Transwell实验和异种移植瘤小鼠模型等，发现LINC01605在膀胱癌细胞和组织中均高表达，且与组织学分级和临床分期有关，并通过生存分析证实LINC01605高表达的患者预后差，并发现LINC01605可激活上皮间质转化(EMT)，促进基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotein,MMP-9)的表达，认为LINC01605可以通过激活EMT信号通路和上调MMP-9表达，促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此研究的部分结论与本研究在口腔鳞癌的结论相仿。本研究结果还显示LINC01605的表达与肿瘤的分化程度相关，提示LINC01605对肿瘤由幼稚到成熟的分化过程可能有调控作用，即LINC01605对肿瘤分化可能有抑制作用[11]。低分化的肿瘤细胞常伴有更原始的形态、细胞有多向分化及旺盛的生长能力，LINC01605在趋于原始的肿瘤细胞中具有高表达，或者说具有标记作用，提示LINC01605可能具有干细胞的标记作用或促进干细胞分化的相关功能[12]，但这需要后续更多实验来证实。本研究结果还显示LINC01605的表达与肿瘤的脉管癌栓相关，提示LINC01605高表达可能对促进肿瘤细胞的脉管侵犯或肿瘤细胞的迁移有关，也提示LINC01605高表达预示着肿瘤具有较强的侵袭性[13]。LINC01605的作用方式复杂，其在肿瘤中的相关调控功能多，虽然多种靶因子如miR-145[14]和EZH2等[15]是已被证实的调节轴，但是由于其下游因子众多[16-17]，其生物学调节通路可能具有交叉性及协同性。Yue等[18]从GSE97300、GSE84983、GSE110715、GSE70880和GSE75970微阵列中筛选差异表达的LncRNA，分析LINC01605的表达与登记的结直腺癌患者的临床表型之间的相关性，发现LINC01605在肿瘤中高表达，不仅证实了其高表达患者预后差，还发现了LINC01605受SMYD2-EP300介导的组蛋白H3K4me3和H3K27ac修饰的调节，并发现LINC01605与METTL3结合能促进SPTBN2 mRNA的m6A修饰，促进SPTBN2的翻译，认为这是结肠癌发生的机制之一。Garcia-Etxebarria等[19]发现LINC01605、PROKR2和CCSER1基因可能是结肠腺瘤恶变的风险基因，且LINC01605可以作为预测结肠癌风险模型的重要因子。因此要阐明LINC01605的表达特征与机制有待更多实验来进一步明确，这不仅对阐明鳞癌的进展有意义[20-21]，还对基于ceRNA理论阐明LINC01605的作用过程有更深入的理解[22-23]。本研究结果证明LINC01605高表达患者的预后差，提示检测LINC01605的表达对初步判断口腔鳞癌的预后有一定价值，但是这需要后续研究进行多中心、大样本等研究后明确，并对其可能的临界值进行确定。学者在其他的恶性肿瘤中也发现了LINC01605对预后判断有一定价值[10]，LINC01605在不同肿瘤中对预后判断的价值也是后续研究的内容。

总之，口腔鳞癌中LINC01605的表达升高，在病变的形成和进展中有重要作用，LINC01605与增殖指标具有相关性，术后检测LINC01605的表达对判断预后可能有一定价值。