胃泌素释放肽及其受体在兔耳增生性瘢痕组织中的表达及与瘢痕组织内巨噬细胞浸润相关性研究

霍君艺，赵卓伟，段策中，刘佳慧，荆银磊

(空军军医大学唐都医院烧伤整形科，陕西 西安 710038)

增生性瘢痕(Hyperplastic scar)，也被称作肥厚性瘢痕，是真皮或者深部组织损伤或病变后，由新生结缔组织过度增生修复而引起的一种隆起、表面光滑的暗红色肿物，外观形状走势与外伤伤口或创面一致[1]。尽管大部分增生性瘢痕并不会威胁患者生命安全，而且会随时间的推移逐渐萎缩和症状变轻，但其会严重影响患者外观和日常生活，给患者带来心理疾病。目前，临床上对增生性瘢痕的治疗主要包括药物治疗、手术治疗和物理治疗等，然而无论哪种治疗方式目前在临床上都不成熟，其临床疗效均不确切，主要原因是对增生性瘢痕形成机制不明确[2-3]。研究[4-6]发现，神经肽是增生性瘢痕形成过程的促进物质，在瘢痕组织中表达升高，是增生性瘢痕发生的主要原因之一。胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide，GRP)是神经肽的一种，其主要由感觉神经细胞合成并释放，通过与胃泌素释放肽受体(Gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)结合而发挥介导脊髓中瘙痒感觉的产生[7-8]。崔婧博等[9]比较人瘢痕疙瘩组织和正常人表皮组织中GRP和GRPR的表达发现，人瘢痕疙瘩组织中GRP和GRPR表达升高，但其对瘢痕形成过程中发挥的具体作用的目前尚不清楚。本研究建立兔耳增生性瘢痕模型，通过检测GRP和GRPR在不同时期兔耳增生性瘢痕中的表达情况，以探讨其表达对增生性瘢痕形成的影响，并探讨其具体机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性新西兰兔，年龄1～1.2岁，体重2～2.5 kg，共计18只均购买自上海灵畅生物科技有限公司。所有新西兰兔均被饲养在温度为16～26 ℃，相对湿度40%～70%，通风以及12 h白昼条件下，在单笼适应性喂养1周后被随机分为对照组、瘢痕A组和瘢痕B组进行实验。

1.2 主要仪器与试剂 组织RNA提取试剂盒(RN002 plus，广州佰汇生物科技有限公司)，反转录试剂盒(NH01047，广州洛唯尔生物科技有限公司)，qPCR试剂盒(P917930,上海麦克林生化科技有限公司)，组织HE染色试剂盒(SL7070,北京酷来博科技有限公司)。皮肤活检穿孔器(15110-40，PELCO)，生物显微镜(CX33，奥利巴斯)。

1.3 兔耳增生性瘢痕模型的建立 所有兔子在禁食12 h后，通过耳静脉注射3%戊巴比妥钠(1.5 mg/kg)进行麻醉，然后使用皮肤活检打孔器在瘢痕A组每只兔子每个耳朵上制作一个直径为0.6 cm创面，在瘢痕B组每只兔子每个耳朵制作一个直径为1.0 cm的创面，充分热凝止血。对照组每只兔子每个耳朵仅进行麻醉和热凝，而不制作创面。

1.4 观察指标

1.4.1 GRP、GRPR和F4/80 mRNA表达检测：兔耳创面分别建立1个月(增生期)、2个月(消退期)和3个月(成熟期)时，随机在每组选取3只兔子，安乐死后取兔耳瘢痕组织(对照组取对应部位正常表皮)，所有组织通过组织RNA提取试剂盒提取总RNA，然后使用反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，最后按照qPCR试剂盒说明配置qPCR反应体系以检测GRP、GRPR和F4/80 mRNA表达。qPCR引物如下：GRP-F:5’-AGAGCGTCCAACTTCCTCAC-3’，GRP-R:5’-TGCAGCCCAAAGATCTCGAC-3’；GRPR-F:5’-GCTCTCCAAGGGTGATAGACG-3’，GRPR-R:5’-CCTTGTGCAATCAGCTCCCT-3’；F4/80-F:5’-ATCTGCAAGCCAGGAAGAGTC-3’，F4/80-R:5’-CTTGCTTGATGCTTTGGTCTGT-3’；β-actin-F:5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’，β-actin-R:5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATG-3’。

1.4.2 巨噬细胞浸润检测：兔耳创面分别建立1个月(增生期)、2个月(消退期)和3个月(成熟期)时，随机在每组选取3只兔子，安乐死后取兔耳瘢痕组织(对照组取对应部位正常表皮)，所有组织均使用HE染色试剂盒进行HE染色，然后在显微镜下观察，巨噬细胞呈圆形、椭圆形或不规则形状、体积较大、核呈圆形或椭圆形、胞质内有时可见吞噬颗粒。

2 结 果

2.1 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中GRP mRNA表达比较 见表1。GRP mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕组织的表达水平均显著高于对照组正常兔耳表皮组织(均P<0.05)，并且GRP mRNA在瘢痕A组的表达水平低于瘢痕B组(P<0.05)。

表1 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中GRP mRNA表达比较

2.2 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中GRPR mRNA表达比较 见表2。GRPR mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕组织的表达水平均显著高于对照组正常兔耳表皮组织(均P<0.05)，并且GRPR mRNA在瘢痕A组的表达水平低于瘢痕B组(P<0.05)。

表2 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中GRPR mRNA表达比较

2.3 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中F4/80 mRNA表达比较 见表3。F4/80 mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕组织的表达水平均显著高于对照组正常兔耳表皮组织(均P<0.05)，并且F4/80 mRNA在瘢痕A组的表达水平低于瘢痕B组(P<0.05)。

表3 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中F4/80 mRNA表达比较

2.4 GRP、GRPR与兔耳增生性瘢痕组织中F4/80表达的相关性 见表4。在瘢痕A组、瘢痕B组增生期，兔耳增生性瘢痕组织中F4/80 mRNA表达水平与GRP、GRPR均呈正相关(P<0.05)。

表4 兔耳增生性瘢痕组织中F4/80表达与GRP、GRPR表达的相关性

2.5 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中巨噬细胞浸润数目比较 见表5。在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕组织中浸润巨噬细胞数目均显著高于对照组正常兔耳表皮组织(均P<0.05)，且瘢痕A组兔耳增生性瘢痕组织中巨噬细胞浸润数目低于瘢痕B组(P<0.05)。

表5 各组不同时期兔耳增生性瘢痕组织中巨噬细胞浸润数目比较(个/高倍视野)

2.6 GRP、GRPR与兔耳增生性瘢痕组织中浸润巨噬细胞数目的相关性 见表6。在瘢痕A组、瘢痕B组增生期，兔耳增生性瘢痕组织浸润的巨噬细胞数目与GRP、GRPR均呈正相关(均P<0.05)。

表6 兔耳增生性瘢痕组织中浸润巨噬细胞数目与GRP、GRPR表达的相关性

3 讨 论

增生性瘢痕，是目前最常见的瘢痕类型之一，对于深及真皮深层的伤口形成增生性瘢痕风险较大，并且亚洲人群风险高于其他人群。灼痛和瘙痒感是增生性瘢痕形成过程中最明显的临床特征，然而对于增生性瘢痕形成过程中灼痛和瘙痒感产生的原因目前尚无一致的观点。研究[10-11]发现，在皮肤出现创伤时，感觉神经和自主皮肤神经就会合成和分泌神经肽，包括降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质、神经激肽A和血管活性肠肽(VIP)；这些神经肽在伤口愈合的不同阶段发挥不同的功能，比如在伤口炎症期神经肽发挥促进炎症细胞因子表达和分泌的功能，在瘢痕形成的过程中，神经肽又会刺激脊髓背根神经节以产生瘙痒感觉。总之，由感觉神经和自主神经纤维分泌的许多神经肽在伤口愈合的不同阶段均起着重要作用。

GRP是一种由神经和内分泌来源的细胞分泌的神经肽，由27个氨基酸组织，最初是从猪的胃组织中被分离出[8-9]。研究[12-13]发现，GRP广泛分布于中枢和外周神经系统，它可以促进角质形成细胞的迁移、增殖和血管生成，刺激角质形成细胞的增殖和迁移，在瘢痕组织形成的过程中发挥重要作用。为研究胃泌素释放肽及其受体在增生性瘢痕组织中的作用，本研究建立兔耳增生性瘢痕组织模型，并在增生性瘢痕的不同阶段检测GRP和GRPR的表达，结果发现：GRP和GRPR mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕组织的表达水平均显著高于对照组正常兔耳表皮组织，并且兔耳创面越大GRP和GRPR mRNA表达越高，GRP和GRPR随兔耳创面愈合时间延长表达降低，这一结果与崔婧博[9]和邱欣等[14]的研究结果一致。崔婧博等[9]在人瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中检测GRP和GRPR表达发现，GRP和GRPR在人瘢痕疙瘩中的表达水平显著高于正常皮肤，与本次研究不同的是：崔婧博等并未研究瘢痕形成不同时期GRP和GRPR表达情况；而邱欣等[14]研究发现，YAP蛋白在兔耳增生性瘢痕的不同时期表达不同，并且与创面呈正相关，表明YAP蛋白与兔增生性瘢痕的形成有关。结合本研究结果表明，GRP和GRPR参与到增生性瘢痕形成的过程中。

进一步分析可知：GRP和GRPR在近年来被大量报道与炎症性疾病的发生发展有关[15-16]，而持续局部炎症和过多的胶原蛋白沉积是增生性瘢痕的主要特征[17-18]；并且伤口处炎症强度与最终瘢痕形成的面积呈正相关，这也可以解释GRP和GRPR在创面较大的瘢痕B组表达水平显著高于创面较小的瘢痕A组。此外，之前的研究[19]还发现，GRP被发现可以促进纤维化细胞的增殖和纤维化的形成，而组织纤维化和胶原蛋白的过度沉积是增生性瘢痕形成的先决条件。因此，根据本研究结果和之前的研究结论，我们推测GRP和GRPR通过参与调节伤口愈合过程中的炎性反应和纤维化细胞的增殖影响增生性瘢痕的形成。

为进一步研究GRP和GRPR调控增生性瘢痕形成的分子机制，本研究分析GRP和GRPR与不同时期增生性瘢痕组织内巨噬细胞浸润的相关性，结果发现：GRP和GRPR mRNA表达水平与F4/80 mRNA表达水平、巨噬细胞浸润数目均呈正相关。炎症细胞是炎性反应的执行者，浸润的炎症细胞在伤口愈合和增生性瘢痕形成的过程中发挥着重要作用，尤其是巨噬细胞[20]。巨噬细胞参与创面修复和瘢痕形成的全过程，其不仅可以在伤口愈合初期帮助吞噬病原微生物、坏死组织以促进伤口愈合，还在瘢痕形成过程中通过分泌TGF-β、血小板衍生生长因子以及碱性成纤维细胞生长因子等胶原物质促进瘢痕的形成[20]。而GRP和GRPR在兔耳增生性瘢痕形成的不同时期与增生性瘢痕组织内浸润的巨噬细胞数目呈正相关，这表明GRP和GRPR也参与到创面修复和瘢痕形成的全过程。

综上所述，GRP和GRPR在兔耳增生性瘢痕组织内表达升高，并且其表达升高与创面大小有关，均随创面愈合而降低，且与增生性瘢痕组织内巨噬细胞浸润呈正相关。