学龄期肥胖儿童尿液中小分子代谢物研究

张艳涛 陈 黎 朱一冰 王淑玲 苟小军

1.上海市宝山区中西医结合医院儿科，上海 201999；2.杭州师范大学医学部药学院，浙江杭州 310012

在过去的30 年里，肥胖已成为一种全球流行病。在中国，随着社会经济的快速发展，高热量、高脂肪的食物在儿童饮食中越来越受欢迎，这些因素已成为儿童肥胖的主要原因。因此，在中国，儿童和青少年的超重和肥胖患病率迅速上升[1]。儿童和青少年的肥胖可能会持续到成年期，更有可能在年轻时患上糖尿病和心血管疾病等非传染性疾病[2]。儿童肥胖虽然诊断已明确，但逆转和治疗仍十分困难，治疗的特效药物选择范围有限，其发病机制尚不完全清楚[3]。

代谢组学是一种高通量技术，目的是鉴定和研究在某些病理代谢反应中形成的相关代谢产物，并了解疾病的分子机制[4]。代谢组学已成为人们普遍关注的研究领域，作为疾病的筛查、诊断、治疗和预后的重要手段，得到了广泛应用[5]，例如应用于临床肝性脑病的诊断和治疗[6]、妊娠期肝内胆汁淤积症的早期诊断[7]、阿尔茨海默病的诊治[8]、2 型糖尿病的诊治[9]。目前，肥胖儿童尿液的代谢表型如何改变，鲜有报道。因此，本研究拟收集其尿液，应用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）技术研究学龄期肥胖儿童和健康对照儿童的尿液代谢谱，确定尿液代谢特征和相关的代谢途径，阐明学龄期儿童肥胖发生的生理病理机制，为预防和早期诊断学龄期肥胖儿童提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

N，O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺[N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide][BSTFA+1%TMCS，购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：B0830]；尿素酶[购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号：SLBB0100V]；盐酸甲氧胺[购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：M0343]。GC/MS联用仪（7890A/5975C，Agilent Technologies）；气相 毛细管色谱柱（HP-5MS，30 m×250 μm i.d.，0.25 μm，Folsom，CA，USA）。

1.2 研究对象

2018 年3 月至12 月，对上海市宝山区中西医结合医院（以下简称“我院”）卫生保健科中体检的学校名单采用随机数字表进行编号，从中随机选取上海市宝山区实验小学、上海大学附属实验学校及宝山共富实验学校3 所学校12～15 岁儿童的体检资料，选出12～15 岁肥胖儿童作为肥胖组（25 名），同时选取一组年龄、性别匹配的正常儿童作为正常组（25 名）。正常组中男12 例，女13 例；平均年龄（13.92±1.09）岁；肥胖组中男15 例，女10 例；平均年龄（14.04±1.08）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究得到我院医学伦理委员会的批准，监护人签署了知情同意书。

1.2.1 肥胖的判定 按照2004 年国际生命科学学会中国肥胖问题工作组确定的《中国学龄儿童青少年超重、肥胖筛查体重指数值分类标准》[10]判定。见表1。

表1 中国学龄儿童青少年超重、肥胖筛查BMI 分类标准（kg/m2）

1.2.2 纳入与排除标准 纳入标准：①年龄12～15 岁；②智力发展正常。排除标准：①病理性肥胖（继发性肥胖）和其他疾病引起的肥胖综合征；②有服用影响血糖、血脂和血压的药物史；③神经系统疾病。

1.3 研究方法

1.3.1 尿液和血清样本采集 样本采集前1 d 20 点以后禁食，取晨尿10 ml，3000 r/min 离心（离心半径13.5 cm）10 min，取上清液分为2 份，-70℃冰箱冻存，待检测。另外，空腹抽取静脉血5 ml，于4℃冰箱静置1 h，3000 r/min 离心（离心半径13.5 cm）10 min，取上清液分为2 份，-70℃冰箱冻存，用于生化检测。

1.3.2 生化检测方法 对照管加入生理盐水0.1 ml 和混合血清0.4 ml，试验管编号以后分别加入谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、葡萄糖（glucose，GLU）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）检测试剂0.1 ml 和混合血清0.4 ml。采用日立全自动生化仪测定空腹血清GPT、GLU、TG、HDL、LDL 含量。

1.3.3 尿液前处理方法和GC/MS 测试条件 尿液前处理方法和GC/MS 检测条件，参考本课题组已经发表的文章[11]。

1.3.4 数据分析 采用ChromaTOF 软件对原始数据进行预处理，导出三维数据矩阵，然后进行除噪音、归一化等过程。将得到的三维矩阵导入SIMCA-P11.0 软件中进行代谢谱及代谢物分析。另外，本研究对选择的25 名肥胖儿童和25 名正常儿童测定了其中有差异的代谢物，并确定了这些代谢物诊断儿童肥胖的价值。采用SPSS 软件对差异代谢物绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线）并计算代谢物在曲线下面积（area under the curve，AUC）。ROC 曲线下的面积可简单、直观地分析诊断试验的临床准确性，AUC 越大，诊断准确性越高，提示该项检验的诊断效能越大。一般认为ROC 曲线的AUC＞0.5，具有一定的诊断价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料采用例数表示，比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 两组一般资料比较

与正常组比较，肥胖组体重、身高、BMI、GPT、TG、LDL 均显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.01 或P ＜0.05），HDL 显著降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图1。

图1 两组一般资料比较

2.2 代谢组学结果与分析

2.2.1 代谢谱分析 为了了解两组尿液样本代谢谱的大致区分情况，采用无监督分析法-主成分分析法对两组尿液代谢谱进行分析。图2 显示，两组尿液样本的代谢谱基本分离，有个别离群点。为了去除与样品分类无关的信息，采用多维统计方法-偏最小二乘法判别分析（partial least squares-discriiminate，PLS-DA）对尿液全谱进行模式判别分析。图3 显示，两组样本代谢谱分离良好，各自聚集在一起，组内的分散度减小，并且该模型具有很高的解释率和预测率（R2Y=0.99，Q2Y=0.95）。为了检验该模型是否存在过度拟合，重复性和可靠性是否良好，确保数据模型的可靠性，本研究进行了排序实验。图4 显示，R2和Q2的截距分别为0.55 和-0.064，Q2的截距为负值，模型有效。以上结果提示，该模型具有较高的稳定性和重复性。

图2 肥胖组和正常组尿液主成分分析法得分图

图3 肥胖组和正常组尿液偏最小二乘法判别分析得分图

图4 100 次排序实验结果

基于PLS-DA 模型，依据权重系数VIP＞1（图5），两组变量间行t 检验，P ＜0.05，获得差异性代谢物。利用NIST 数据库和标准品数据库（Wiley Registry）进行代谢物鉴定，鉴定了38 个代谢物，并考察了代谢物相对浓度的变化趋势，见表2。

表2 肥胖组和正常组尿液间的差异代谢物

图5 肥胖组和正常组尿液代谢V-Plot 图

2.2.2 生物标志物的筛选 38 个代谢物ROC 曲线下面积计算结果显示，18 个代谢物包括缬氨酸、草酸、苯乙胺、枯酸、甘油、磷酸盐、异亮氨酸、苏糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、邻苯二酚、肌酸、酪氨酸、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、烟酸、尿烷酸ROC 曲线下面积均＞0.5，而且P ＜0.05，可作为早期预测儿童肥胖的重要指标。见图6、表3。

表3 尿液代谢物预测儿童肥胖的ROC 曲线分析结果

图6 受试者操作特征工作曲线

2.2.3 代谢通路分析 将缬氨酸、草酸、苯乙胺、枯酸、甘油、磷酸盐、异亮氨酸、苏糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、邻苯二酚、肌酸、酪氨酸、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、烟酸、尿烷酸导入在线系统—MetaboAnalyst 中进行代谢通路分析。将阈值设置为0.10[12]，高于0.10，认为该代谢通路是潜在的代谢通路。本研究有5 种潜在的代谢通路包括（a）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；（b）苯丙氨酸代谢；（c）甘油脂代谢；（d）酪氨酸代谢；（e）组氨酸代谢。见图7。

图7 MetPA 软件鉴定的代谢通路分析图

3 讨论

本研究基于GC/MS 代谢组学技术，建立了肥胖组与正常组尿液代谢谱分析模型，证实了学龄期肥胖儿童具有的尿液代谢特征，鉴定出缬氨酸、草酸、苯乙胺等18 个代谢物，可作为诊断学龄期儿童肥胖的尿液中的潜在标志物。基于MetaboAnalyst 进行了代谢通路分析，学龄期肥胖儿童尿液中有5 种紊乱的代谢通路包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；苯丙氨酸代谢；甘油脂代谢；酪氨酸代谢；组氨酸代谢。

本研究发现缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸在肥胖组尿液中显著升高，尤其缬氨酸相对浓度增加非常显著。缬氨酸和异亮氨酸属于支链氨基酸（branched chain amino acid，BCAAs），BCAAs 可以促进葡萄糖的摄取和骨骼肌蛋白质的合成，还可以被氧化以提供机体的能量[13]。此外，BCAAs与胰岛素抵抗（insulin resis tance，IR）之间有着密切的关系，BCAAs 水平的升高可能会导致IR[14]。与肥胖相关的BCAAs 浓度升高的病因尚不完全清楚，一种可能性是肥胖患者饮食中的BCAAs 含量较高，引起IR，相反，IR 可能导致胰岛素抑制BCAAs 水平的生理功能丧失[15]。营养过剩会增加BCAAs 的浓度，影响胰岛素敏感性和分泌，肥胖与儿童和青少年BCAAs 浓度升高有关，BCAAs 分解代谢增加可能是生命早期出现的营养过剩的后果之一，可能导致胰岛素作用的改变[15]。酪氨酸是蛋白质的组成部分，也是细胞功能的替代能源。肝脏是酪氨酸降解发生的主要器官，可产生糖异生和生酮的中间体或前体，酪氨酸代谢紊乱与多种疾病有关[16]。肝脂质代谢失调是导致IR 的危险因素，酪氨酸水平与空腹胰岛素相关，酪氨酸也与肝脏的脂肪蓄积有关[17]。本研究中肥胖儿童TG 和LDL 均较正常儿童显著升高，也验证了这一点，提示学龄期肥胖儿童患者具有更明显的脂代谢紊乱，可能与IR 有关。

本研究代谢组学显示参与苯丙氨酸代谢的物质苯乙胺，在肥胖组中显著升高。苯乙胺是一种内源性天然单胺生物碱，具有刺激作用，可导致神经递质（多巴胺和5-羟色胺）的释放。苯乙胺与胺相关受体结合，从而抑制多巴胺、5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取[18]。肥胖症是由能量消耗和能量摄入之间的失衡引起，中枢神经系统中的激素、肽和神经递质在肥胖中具有潜在的作用，其通过传入和传出信号调节能量摄入和消耗。许多中枢作用神经递质通过调节食物摄入和/或能量消耗而参与能量稳态。例如参与调节食物摄入量和能量消耗的神经递质——5-羟色胺，存在于特定的弓形促黑素皮质素神经元中，这些弓形促黑素皮质素血清素受体通过改变进食行为来调节能量稳态[19]。学龄期肥胖儿童尿液中苯乙胺升高提示其食物摄入和能量消耗失衡，这些表现可能与神经递质的代谢异常有潜在联系。

本研究中学龄期肥胖儿童尿液中甘油的含量显著增加，提示患者体内存在脂质代谢的紊乱。甘油参与了甘油脂代谢，而甘油脂代谢属于脂质代谢。肥胖是以脂肪组织异常沉积和脂质代谢紊乱为特征的代谢性疾病。脂肪组织可以合成和分泌多种脂肪细胞因子，并调节葡萄糖和脂质代谢，调节胰岛素的敏感性，脂肪细胞因子分泌紊乱是导致肥胖人群IR 的重要病理环节[20-21]。据报道，给予肥胖儿童运动和饮食综合干预可以改善其脂质代谢，增加保护性脂肪细胞因子的分泌，抑制有害的脂肪细胞因子的分泌，并提高其胰岛素的敏感性[22]。

儿童肥胖是全球最具挑战性的公共卫生问题之一，儿童肥胖除了增加传统的心脏代谢危险因素外，还会严重阻碍肾脏功能[23]。小儿肥胖患者的高尿酸血症与代谢受损呈正相关[24]。尿酸是嘌呤氧化代谢分解的终产物，最终在肾脏排泄[25]。高尿酸血症与多种疾病相关，肥胖是高尿酸血症的重要危险因素，高尿酸血症的发生率在肥胖人群中较高，原因可能是肥胖体质摄入过多的热量，为嘌呤合成提供了足够的能量并增加了尿酸的合成[26]。本研究中肥胖儿童尿液中尿酸的浓度显著增加，可能与患者的肥胖体质有关。肌酸水平的上调也可能与体内肾小球滤过率的降低相关。另外，本研究发现草酸、枯酸、磷酸盐、苏糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、邻苯二酚、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、烟酸等代谢物变化显著，这些物质的生物学内涵文献报道较少，今后，还需要进一步的研究。

总之，本研究采用GC/MS 技术对学龄期肥胖儿童和正常儿童的尿液进行检测，结合模式识别分析了学龄期肥胖儿童尿液的代谢特征，筛选出了缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸等多种与学龄期儿童肥胖相关的潜在生物标志物。学龄期儿童肥胖的发生机制可能与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代谢，甘油脂代谢，酪氨酸代谢，组氨酸代谢等代谢异常有关。