橡胶制品中 3 种 N- 亚硝基胺类物质假阳性的鉴别

冯徐根，韩军，孙旸，孙敬，杨萌

（北京市产品质量监督检验院 国家纺织及皮革产品质量监督检验中心，北京 100025）

前言

N- 亚 硝 基胺类物质被认为是最重要的化 学致癌物之一，N- 亚硝基胺可以通过呼吸道、消化道进入人体，也可以通过皮肤的吸收进入人体诱发癌症[1-2]。近年来,随着人民对该类物质重视度的提高，国内外对 N- 亚硝基胺残留量的测定研究越来越多，集中在食品、水和各种日用橡胶制品，如橡胶密封材料、婴儿奶嘴、橡胶玩具及橡胶手套等[3-7],橡胶制品中的 N- 亚硝基胺主要源于橡胶加工所用的仲胺类促进剂，硫化过程中形成仲胺, 再与硝基化试剂反应生成 N- 亚硝基胺[8-9]。

我国国家标准 GB/T24153-2009[10]也提供了橡胶中 N- 亚硝基胺类物质的检测方法。该标准使用气质联用法测定 N- 亚硝基胺类物质，但 N- 亚硝基-N- 甲基苯胺、N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亚硝基二苯基胺具有热不稳定性，在进样口高温条件下会分解为 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，实际测定物质为分解产物 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，而该 3 种分解产物同时也常作为橡胶生产助剂和促进剂广泛应用于橡胶生产中，可能会少量残留于橡胶制品中，如果实际样品中含有这 3种物质，按照 GB/T24153-2009 的方法测试将会得到假阳性结果。

本研究建立了橡胶材料中 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质液相色谱仪和液质联用仪的鉴别方法，3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质化学信息见表 1。

表1 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质化学信息Tab.1 Chemical information of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

1 实验部分

1.1 仪器与材料

仪器：气质联用仪 Agilent 7890A-5975C（安捷伦科技有限公司）；液相色谱仪 Agilent 1260 Infinity（安 捷 伦 科 技 有 限 公 司）； 液 质 联 用 仪 Agilent 1200-641 0B（安捷伦科技 有 限公 司）；超声 波发 生器JP-040（深 圳 市 洁 盟 清 洗 设 备 有 限 公 司）；旋 转 蒸 发仪（瑞士步琦有限公司）。

标准物质、试剂、材料：N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺（标准物质，99.5%，FirstStandard）；N- 亚硝基 -N-乙基苯胺（标准物质，98.4%，FirstStandard）；N- 亚硝基二苯基胺（标准物质，98.0%，FirstStandard）；N- 甲基苯胺（标准物质，98.9%，BePure）；N- 乙基苯胺（标准 物 质 ，99.2% ，BePure）； 二 苯 胺 （ 标 准 物 质 ，1000μg/mL，BePure）；甲醇（色谱纯,国药集团化学试剂有限公司）；黑色橡胶（经检测不含 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质）。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取 0.0250 g 的 N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺、N- 亚硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺，用色谱纯甲醇定容至 25 mL，得到质量浓度均为 1000 μg/mL 的单种标准储备溶液，使用时用甲醇将标准储备溶液稀释至所需浓度。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 气质联用仪 GC-MS

色谱柱：DB-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：140 ℃；质谱接口温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；载气：氦气，流速：1.0 mL/min；电离方式：EI 源；进样方式：不分流进样；升温程序：38 ℃保持 2 min，以 20 ℃/min 升温至 250 ℃，保持 2 min；质量扫描范围：50～200 amu。

1.3.2 液相色谱仪 HPLC

色谱柱：Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：15 μL；流动相 A：二级水，流动相 B：乙腈；梯度洗脱程序：0～8 min，50%A 等度洗脱；8～10 min，A 由 50%线性降至 40%，保持 5 min；二极管阵列检测器，检测波长：243 nm、270 nm、282 nm。

1.3.3 液质联用仪 LC-MS

色谱柱：ZORBAX XDB-C18(50 mm×2.1 mm×5 μm)流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL；流动相 A：二级水，流动相 B：乙腈；梯度洗脱程序：0～4 min，A 由 80%线性降至 40%，保持 0.5 min；离子源：ESI；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多重反应监 测（MRM）；电 喷 雾 电 压 ：4000 V；雾 化 器 压 力 ：40 psi；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：11 L/min。

1.4 前处理

按照 GB/T24153-2009 标准中的前处理方法对样品进行前处理，样品萃取液转移至棕色进样瓶中，于 4 ℃条件下冷藏待测。

2 结果与讨论

2.1 气质联用仪检测结果

使用 GB/T24153-2009 标准中的气质联用仪分析条件分析 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质色谱图见图 1，质谱图见图 2～ 图 4。

图1 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质GC-MS 色谱图Fig.1 GC-MS Chromatogram of 3 N-nitrosamines and 3 false positive substances

图2 N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺、N- 甲基苯胺 GC-MS 质谱图Fig.2 Mass spectrum of N-nitroso-N-methylaniline and Nmethylaniline with GC-MS

图3 N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺、N- 乙基苯胺 GC-MS质谱图Fig.3 Mass spectrum of N-nitroso-N-ethylaniline and Nethylaniline with GC-MS

由图 1～ 图 4 可知，3 种 N- 亚硝基胺类物质与其对应的 3 种假阳性物质在保留时间、特征离子和特 征 离 子 丰 度 比 上 均一 致 ， 结 果 表 明 ： 采 用GB/T24153-2009 标准中的仪器分析条件，无法分辨3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质。

图4 N- 亚硝基二苯基苯胺、二苯胺 GC-MS 质谱图Fig.4 Mass spectrum of N-nitrosodiphenylaniline and diphenylamine with GC-MS

2.2 假阳性原因分析

N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亚硝基二苯基胺具有热不稳定性，高温条件下容易分解，在进样口的高温条件下，N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺和N- 亚硝基二苯基胺会分解成 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，同时还会生成副产物 N- 甲基羟乙基苯胺、2,3,3- 三甲基 -1- 苯基氮杂环丁烷和 N-乙 基 羟 乙 基 苯 胺 。 所 以 使 用 气 质 联 用 仪 采 用GB/T24153-2009 标准中仪器条件分析 N- 亚硝基-N- 甲基苯胺、N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亚硝基二苯基胺时，实际测定的是其分解产物 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺。N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺作为橡胶生产助剂和促进剂广泛应用于橡胶生产中，可能会少量残留于橡胶产品中 ， 如 果 实 际 样 品 中 含 有 这 3 种 物 质 ， 按 照GB/T24153-2009 的测试方法将会得到假阳性的结果。所以需降低进样口温度防止物质分解或采用其他分析方法来分辨 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质。

2.3 气质联用法鉴别方法的确定

陶进熊等人研究了气质联用仪进样口温度对N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺和 N- 亚硝基 -N- 乙基苯胺的影响[11]，但并未研究 N- 亚硝基二苯基胺在进样口高温条件下的分解情况，所以基于上述研究结果，进样口温度分别选择 100、140 和 180 ℃，比较不同进样口温度对 N- 亚硝基二苯基胺结果的影响，结果见图 5。

结合图 5 及物质对应的质谱图可知，进样口温度为 100 ℃时，N- 亚硝基二苯基胺已经分解为二苯胺，过低的进样口温度还会影响样品溶液的气化效果，结果表明：气质联用法目前不适应于 N- 亚硝基二苯基胺的检测。文献[12]显示，N- 亚硝基二苯基胺热稳定性不好，通常采用测定其分解产物二苯胺对 N- 亚硝基二苯基胺进行定量。但二苯胺也可作为防老剂应用于橡胶生产中[13]，势必会在检测中有假阳性的情况发生，所以还应结合使用其他分析手段鉴别 N- 亚硝基二苯基胺和二苯胺。

图5 不同进样口温度下 N- 亚硝基二苯基胺的 GC-MS色谱图Fig.5 GC-MS Chromatograms of N-nitrosodiphenylamine at different inlet temperatures

使用优化后的分析条件对 2 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质标准溶液进行分析，2 种 N-亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质色谱图见图 6，定量离子、定性离子及保留时间信息见表 2。

图6 2 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质 GC-MS色谱图Fig.6 GC-MS Chromatograms of 2 N-nitrosamine substances and 3 false positive substances

表2 2 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质的 GC-MS 定性离子及定量离子Tab.2 Qualitative and quantitative ions of 2 N-nitrosoamines and 3 false positive substances with GC-MS

2.4 HPLC 鉴别方法的确定

2.4.1 色谱柱的选择

试验考察了 Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm） 和 Eclipse Plus-C18 柱 （250 mm×4.6 mm×5 μm）对 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质的保留和分离效果，发现在同等条件下，两种色谱柱都可以实现 6 种物质的分离，当使用 Eclipse XDB-C18 柱时，6 种物质的分离效果更好，所以本实验选择 Eclipse XDB-C18 柱。

2.4.2 流动相的选择

为保证 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质间良好的色谱分离及响应，分别考察了乙腈 -水流动相体系和甲醇 - 水流动相体系对 6 种物质分离的影响。结果表明，在同等梯度条件下，乙腈 -水流动相体系比甲醇 - 水流动相体系的分离效果更好，峰形更加尖锐，保留时间更短，但色谱峰响应基本一致，所以综合考虑本实验选择乙腈 - 水流动相体系。

2.4.3 检测波长的确定

使用二极管阵列检测器对 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质进行光谱全扫描检测，检测结果表明：N- 亚硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺和 N-乙基苯胺在 240～246 nm 有特征吸收，二苯胺在 282 nm 有特征吸收，而 N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺和 N-亚硝基 -N- 乙基苯胺在 215 nm 和 270 nm 均有特征吸收，综合考虑到越靠近远紫外区，乙腈溶剂和杂质吸收越强，会对目标物造成干扰，所以确定 270 nm 作为 N- 亚硝基 -N- 甲基苯胺和 N- 亚硝基-N- 乙基苯胺的检测波长，243 nm 作为 N- 亚硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺和 N- 乙基苯胺的检测波长，282 nm 作为二苯胺的检测波长。

3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质液相色谱图见图 7，由图7 可知，该方法可以实现 6 种物质的分离，6 种物质在 243 nm、270 nm 和282 nm 下，可以得到较好的峰强度，检测时长为18 min。

图7 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质液相色谱图Fig.7 Liquid chromatograms of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

2.5 液质联用法鉴别方法的确定

使用 ESI 源分别在正离子和负离子模式下对 3种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质进行质谱全扫描。结果表明：在 ESI 源正离子模式下，3 种 N-亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质质谱响应更强，因此电离方式选择正离子模式。

在正离子模式下对 3 种 N- 亚硝基胺类物质及3 种假阳性物质进行全扫描，准分子离子[M+H]-为最高响应强度离子，将其选为母离子后使用选择离子扫描模式优化碎裂电压。采用子离子扫描方式对二级质谱进行分析，选择丰度较强并且干扰较少的子离子分别作为定量离子和定性离子，进一步优化碰撞能量，使各物质的特征碎片离子强度达到最大，具体质谱参数见表 ，使用多重反应监测模式（MRM）扫描 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质，MRM 色谱图见图 8，质谱参数见表 3。

表3 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质的质谱参数Tab.3 Mass spectrometric parameters of 3 N-nitrosamine substances and 3 false positive substances

图8 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质 MRM 色谱图Fig.8 MRM chromatograms of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

2.6 方法线性关系及检出限

以 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质的浓度为横坐标，3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，方法检出限采用试剂空白添加标准溶液完成前处理步骤后进行仪器分析，当 S/N=3 时所对应的浓度为方法检出限。结果表明：液相色谱法的线性相关系数为 0.9928～0.9992，方法检出限为 0.14～0.43 mg/kg，结 果 见 表 4。 液 质 联 用 法 的 线 性 相 关 系 数 为0.9931～0.9968，方法 检 出 限 为 0.10～0.46 mg/kg，结果见表 5。

表4 液相色谱法测 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质的标准曲线及检出限Tab.4 Standard curve and detection limit of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances by HPLC

表5 液质联用法测 3 种 N- 亚硝基胺类物质及 3 种假阳性物质的标准曲线及检出限Tab.5 Standard curve and detection limit of 3 N-nitrosoamine substances and 3 false positive substances by LC-MS/MS

2.7 回收率与精密度

回收率采用基体加入法，选取黑色橡胶作为基体，添加三个水平，分别为 1.0 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg，每个水平平行测定 7 次，结果表明：液相色谱法的加标回收率为 96.7%～103.7%，相对标准偏差为 2.3%～5.4%；液质联用法的加标回收率为 98.1%～106.4%，相对标准偏差为 2.2%～4.2%，均满足日常检测要求。

3 结论

分析了气质联用法测 3 种 N- 亚硝基胺类物质出现假阳性的原因，建立了测定 3 种 N- 亚硝基胺类物质及其 3 种假阳性物质的液相色谱法和液质联用法，优化了仪器参数，能够实现对 3 种物质的准确定量，有助于提高实验室对 N- 亚硝基胺类物质假阳性情况的识别及检测能力，也为其他产品中N- 亚硝基胺类物质的测定提供了参考方法。