揿针疗法对慢阻肺模型大鼠气道形态学及氧化水平的影响

贺建豪，黄培炜，许金森，陈 铭

（1.福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350108；2.福建省中医药科学院经络研究所，福建 福州 350003；3.福建卫生职业技术学院医学系，福建 福州 350101）

慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是以不完全可逆性气流受限为特征的呼吸道疾病，其临床特征包括慢性呼吸系统异常、肺结构异常、肺功能受损，且通常还会伴有其他多器官功能紊乱［1］，主要症状是呼吸困难、慢性咳嗽、咳痰［2］。慢阻肺目前居我国疾病死亡原因的第3位［3］，预计到2030年慢阻肺将成为全世界发病率和病死率的第四大病因［4］，其高患病率、高死亡率和较重的经济负担已成为我国及全球重要的公共卫生问题［5］。揿针作为一种传统干预方式，安全有效，目前国内已有一些临床研究证实在西药治疗基础上辅助揿针治疗可以更好地改善慢阻肺患者症状［6-7］，但相关基础研究较少。鉴于此，本文采用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）联合烟熏建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，观察揿针“肺俞”穴对慢阻肺大鼠的气管、肺组织形态学及血清、肺组织超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影响，初步探讨揿针治疗慢阻肺的机理，为临床使用揿针提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与仪器 18只雄性SD大鼠购自上海斯莱克实验有限责任公司，体质量（180±20）g，9周龄，清洁级，许可证及合格证号码分别为：SCXK（泸）2017-0005，20170005006824。自制气管滴管；自制烟熏箱（100 cm×80 cm×50 cm）；DNP-9162型恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；多功能酶标分析仪（瑞士帝肯公司，型号：Infinite F50）；L660低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；YT-7FB型生物组织摊烤片机、ZT-14V2型组织脱水机、YB-7LF型包埋机均购自孝感市亚光医用电子技术有限公司；RM2255型石蜡切片机（德国莱卡公司）。

1.1.2 材料与试剂 白色七匹狼牌香烟（福建中烟工业有限责任公司，每支含一氧化碳13 mg、烟碱0.9 mg、焦油量12 mg）；LPS（中国生物检验检定所，规格：100 mg，批号：S09M10I87813）；一次性使用无菌揿针（吴江市云龙医疗器械有限公司，规格：0.25×2.0 mm）；4%多聚甲醛（兰杰柯科技有限公司）；MDA、SOD检测试剂盒（均购自上海酶联生物科技有限公司，货号分别为ml077384、ml001998，批号均为03/2021）。

1.2 方 法

1.2.1 分组及模型制备 SD大鼠适应性喂养1周，按随机数字表分为正常组、模型组、揿针组，每组6只。后两组采用LPS气管内滴注+烟熏的方式造模［8］。造模方法：造模第1日用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采用自制气管插管，气管内滴注1 mg/mL的LPS溶液，0.2 mL/只，休息1周。第2周开始置于烟熏箱，首先一次性点燃15支白色七匹狼香烟后放入烟熏箱内，关闭烟熏箱，每次30 min，每天1次，连续熏4周；继而进行第2次气管滴注1 mg/mL的LPS溶液，0.3 mL/只。休息1周后，用20支香烟熏4周，每天1次，每次30 min。造模共耗时10周，其中LPS滴注2次，休息2周，烟熏8周。正常组大鼠于相同时间点暴露于空气中。

1.2.2 干预 于造模第8周开始对双侧“肺俞”穴进行干预，将腧穴部位及其周围去毛，定位“肺俞”穴［9］，将揿针刺入“肺俞”穴，按揉“肺俞”2 min，每隔30 min按揉1次，共循环4次，总按揉时间为8 min，其余时间用胶布固定揿针，1次/d，每周干预6 d，连续干预3周，取针时一手固定大鼠，另一手用镊子将胶布向外撕下。模型组除无揿针干预以外，其他都与揿针组相同。

1.2.3 观察指标 干预结束次日，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，切开腹部，用纱布拨开组织找到腹主动脉，用采血针进行腹主动脉采血，离心取上清液，存于-80℃冰箱待用；取右侧固定位置的一块肺组织，低温冷冻破碎，以0.1 mg样本加1 mL预冷PBS重悬，2～8℃，12 000RPM，离心取上清液存于-80℃冰箱，待用ELISA法检测SOD及MDA，严格遵照试剂盒中说明书操作。取气管、左侧固定边缘位置的肺组织，将其浸泡于4%的多聚甲醛中固定，在光学显微镜下观察经过脱水、包埋、切片等过程后的气管及肺组织病理改变并拍摄图片。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，如果3组数据均符合正态性分布，则选择单因素方差分析；如果3组中有一组数据不符合正态性分布，则选择秩和检验；分析结果均以均值±标准差（±s）来表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠气管、肺组织病理形态学

正常组大鼠气管黏膜上皮完整（表面平滑），纤毛细胞游离面的纤毛未见异常；与正常组比较，模型组大鼠气管黏膜上皮细胞增厚（表面毛糙），纤毛细胞增多，纤毛长度变长；与模型组比较，揿针组上皮细胞无明显增厚（表面较平滑），纤毛细胞少，纤毛长度短。正常组大鼠肺泡结构未见异常，肺泡壁结构较完整，极少量炎性细胞浸润；与正常组比较，模型组大鼠肺内肺泡间隔破裂融合形成肺大泡，肺泡腔明显扩张，肺间质内见炎性细胞浸润；与模型组比较，揿针组大鼠肺中融合的肺大泡数量减少，肺间质内炎性细胞浸润减少。结果见图1。

图1 各组大鼠气管、肺组织病理图

2.2 各组大鼠血清、肺组织中SOD、MDA含量

与正常组比较，模型组大鼠血清、肺组织MDA含量增加（P＜0.05，P＜0.01）；肺组织SOD含量下降（P＜0.01）；与模型组比较，揿针组大鼠血清MDA含量下降（P＜0.01）、肺组织SOD含量增加（P＜0.05）。结果见表1。

表1 3组大鼠血清、肺组织SOD和MDA含量比较 （±s）

表1 3组大鼠血清、肺组织SOD和MDA含量比较 （±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01

组别n 血清肺组织SOD（ng/mL）MDA（nmol/mL）SOD（ng/mL）MDA（nmol/L）正常组6 9.766±0.879 5.478±0.101 11.045±0.420 4.737±0.391模型组6 9.102±0.634 5.908±0.1692）9.944±0.7262）5.141±0.1921）揿针组6 9.271±0.521 5.532±0.1264）10.942±0.6273）5.138±0.192 F值1.480 18.079 6.063 4.300 P值0.259 0.000 0.012 0.033

3 讨论

慢阻肺属中医学“肺胀”“咳嗽”“喘证”等范畴，常累及肝、脾、肾等脏，病机为本虚标实，急性期以标实为主，慢性期以本虚为主。糖皮质激素雾化吸入、长期吸氧、支气管扩张剂等对症支持治疗是目前主要的治疗方法，但是这些药物长期使用会带来感染、心血管事件等不良反应。尽管现代医学在考虑如何使用药物治疗慢阻肺时尽可能减少副作用，但仍未找到解决此问题的方法［10］。

揿针长度较短，约为2～2.5 mm，只触及皮下，不达深部，也不损伤大血管、神经，是一种安全、有效的干预方式，适用于需要长时间留针的慢性疾病。揿针疗法的相关理论来源于《黄帝内经》中关于浮刺及《灵枢·官针》中关于久留针的论述，是十二皮部理论、卫气理论、经络腧穴学说、针刺理论共同指导下的实际应用［11］。《针灸甲乙经》载：“肺气热，呼吸不得卧，上气呕沫，喘气相追逐，胸满胁膺急，息难，肺俞主之……肺胀者，肺俞主之。”《素问·咳论》曰：“治脏者，治其俞。”肺俞穴作为足太阳膀胱经的一个重要穴位，在临床和科研中应用频繁。肺俞穴为肺气所转输、输注的部位，与肺脏相应。当肺部有疾时，肺俞穴处会出现敏化现象，此时刺激此穴可以达到调节肺脏气血的作用，损有余而补不足，维持人体气血阴阳动态平衡［12］。有临床研究表明揿针肺俞联合八珍汤可降低患者TNF-α含量、升高IL-10含量，并且能提高6 min行走距离，明显改善慢阻肺所引起的各种临床症状［13］。

LPS联合烟熏是一种耗时长的造模方法，可以成功制作慢阻肺模型。LPS是空气污染物中革兰氏阴性菌细胞壁的一个组成部分，细菌侵入生物体后，其细胞壁的LPS触发单核细胞、巨噬细胞释放炎性因子，在气道和肺组织中诱发炎症反应。香烟燃烧后会产生较高浓度的氧化产物和氧自由基，通过不同途径刺激肺部产生炎症，导致大量中性粒细胞和巨噬细胞往肺部和气道迁移。中性粒细胞会释放基质金属蛋白酶（MMP）-8、MMP-9、弹性蛋白酶（NE）等，它们对肺泡组织有破坏作用。NE和MMP-9会降解弹性蛋白、胶原蛋白等多种细胞外基质成分；MMP-8拥有胶原酶活性，可以破坏肺泡间隔的正常结构，而间隔细胞的正常功能是保持肺泡结构完整性的前提。巨噬细胞中检测到的巨噬细胞弹性蛋白酶（MMP-12）可以降解弹性蛋白，形成的片段会趋化单核细胞和成纤维细胞，从而促进炎症反应，加速肺组织结构破坏［14］。纤毛细胞是气管黏膜上皮的组成成分之一，呈柱状，游离面有纤毛，当纤毛快速摆动时，可将黏液及附在其上的细菌、尘埃推向咽部，经咳嗽反射咳出，以净化吸入的空气，长期吸烟可使纤毛变形、膨胀［15］。通过上述形态学的结果可知，模型组大鼠的气管黏膜上皮增厚，纤毛细胞增多，纤毛变长，肺泡间隔破裂，有炎性细胞浸润。而揿针肺俞可以使气管、肺组织的病理改变减轻，说明揿针肺俞穴可以在一定程度上治疗慢阻肺。本研究造模时间较长，因为课题组前期预实验发现停止烟熏后大鼠自行恢复速度较快，会影响揿针干预慢阻肺大鼠效果的判断。

氧化/抗氧化失衡是慢阻肺发生的重要机制之一，生理状况下人体内的氧化剂与抗氧化剂处于动态平衡，当二者处于不平衡时会出现氧化应激反应，导致细胞死亡和组织损伤。肺脏因其拥有丰富的血供和呼吸膜面积大等独特的组织结构特点，极易受到活性氧（ROS）、活性氮（RNS）及脂质过氧化产物等内源性氧化剂的损害［16］。MDA可间接反映细胞受损害的程度，是脂质过氧化的标志，因其由ROS和不饱和脂肪酸反应分解而来，可交联机体内大分子如蛋白质、核酸和脂类，引起生物膜变性，致使细胞死亡［17］。SOD是内源性抗氧化剂中的一种抗氧化酶，也是一种金属活性酶，它可消除超氧阴离子自由基，阻止细胞核氧化裂解，进而防止生物细胞损伤凋亡［18］。

由表1可知，与正常组比较，模型组大鼠血清SOD含量有下降趋势，肺组织SOD含量显著下降，推测是香烟燃烧后产生的大量氧自由基首先被大鼠吸入肺部，机体启动保护反应，肺中SOD因要消除大量氧自由基而比血液中消耗更多；模型组大鼠肺组织MDA含量上升，血清MDA含量显著上升，说明机体存在肺部及血液中细胞受损害的情况，且血液中细胞受损害更严重，推测是肺中大量消耗的SOD清除了一部分氧自由基，减少了肺部细胞的损伤。与模型组比较，揿针组大鼠肺组织MDA含量变化不大，肺组织SOD含量上升，说明揿针可以增加肺中SOD含量以更多的消耗香烟产生的氧自由基，有效防止肺部细胞进一步损伤。血清MDA含量显著下降，SOD有上升趋势，说明揿针可以有效减轻血液中的细胞受损伤程度。综上所述，我们可知揿针可以在一定程度改善机体氧化/抗氧化失衡状态。

慢阻肺公认的发病机制除氧化-抗氧化失衡外，还有炎症机制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、自身免疫性疾病以及最新的细胞凋亡学说等，目前仅依靠一种机制不足以解释慢阻肺的复杂病理，不同机制之间可能发生相互作用，比如氧化应激可以引起蛋白酶抗蛋白酶失衡、放大炎症、引起自身免疫反应［19］，后续笔者将继续观察揿针肺俞在抗炎及纠正蛋白酶-抗蛋白酶等方面的作用，为临床应用揿针提供实验依据。