海洋产脲酶细菌的筛选及诱导形成碳酸钙矿物的特征

陈慧佳，张慧卿，冯 莹，魏士平

(中国地质大学(北京)海洋学院，北京 100083)

0 引 言

生物矿化是指生物通过代谢活动致使矿物形成的过程，依据生物对矿物的制约程度可分为生物控制的矿化、生物影响的矿化和生物诱导的矿化[1-3]。其中，生物诱导的矿化是通过生物自身的生理代谢活动，引起周围环境的改变，导致矿物离子过饱和而发生沉淀的过程[2]。由微生物诱导的碳酸钙沉淀(MICP)是一种典型的生物诱导的矿化作用，是地质微生物学研究领域最为关注的热点之一[4]，其作用机制对于揭示不同地质历史时期碳酸盐的成因具有重要的启示意义[5]。此外，微生物对碳酸盐的矿化还可以被广泛应用于地质与环境工程各个领域，比如二氧化碳的封存、重金属的去除、土壤性能的改良和微生物水泥的制备等[2,6-11]。

研究表明，碳酸盐沉淀与多种微生物的代谢活动有关，如光合作用、尿素水解、反硝化、氨化、硫酸盐还原和甲烷氧化等[12]。在这些代谢活动中，较常见的代谢活动是脲酶催化的尿素水解，通常发生在产脲酶细菌中，其诱导形成碳酸钙沉淀是微生物诱导矿化中的一种重要途径[2,13]。产脲酶细菌通过自身产生的脲酶催化尿素分解生成NH3和HCO3-，NH3进一步和H2O结合生成NH4+和OH-，从而导致pH值升高，促使HCO3-在碱性条件下向CO32-转化，CO32-进一步和环境中的Ca2+结合，最终导致CaCO3发生沉淀[14-15]。

产脲酶细菌广泛分布于各种不同的环境，如土壤、海洋、岩洞和盐水湖等[16]，常见的产脲酶细菌有巴氏生孢八叠球菌(Sporosarcinapasteurii)[17-19]、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)[18,20]、芽孢杆菌(Bacillussp.)[21-22]等。细菌诱导形成的碳酸钙沉淀通常有三种晶相：方解石、文石和球霰石，其中方解石是碳酸钙变体中最稳定的一种晶相；细菌诱导形成的碳酸钙矿物以方解石和球霰石最为普遍[2,7,23-25]，有些细菌只诱导形成方解石，如迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)[26-27]；而有些细菌则只诱导形成球霰石，如自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)[26,28]；还有一些细菌可同时诱导形成方解石和球霰石，如气芽孢杆菌(Bacillusaerius)[29]；而细菌S.pasteurii依据不同条件可形成不同的碳酸钙晶相[29-30]。据前人报道，不同细菌所产生的脲酶具有特定的氨基酸序列，脲酶中不同氨基酸组成可能对碳酸钙晶相的形成产生影响[14-31]。此外，细菌细胞外多糖(EPS)、培养条件(pH值)、细菌细胞表面结构及其化学性质等也可能是诱导碳酸钙沉淀并控制碳酸钙多晶形成的原因[16,32-34]。目前对于不同细菌在诱导形成碳酸钙沉淀时，细菌影响碳酸钙矿物晶相的机制还有待于进一步研究。

本研究从北戴河新河河口区海洋沉积物中分离并筛选产脲酶细菌，探究其诱导碳酸钙矿物沉淀及矿物特性，对于认识海洋中产脲酶细菌的多样性及其矿化特征具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所需琼脂由北京奥博星生物技术有限公司生产；其他试剂由北京化工厂生产；细菌基因组DNA提取试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司生产。立式高压蒸汽灭菌锅、pH计由上海博远实业有限公司医疗设备厂生产；离心机由上海卢湘仪离心机仪器有限公司生产；精密电子天平由赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产。

牛肉膏蛋白胨培养基成分(g/L)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值7，琼脂20 g。

产脲酶细菌筛选培养基成分(g/L)：蛋白胨1 g，氯化钠5 g，葡萄糖1 g，磷酸二氢钾2 g，苯酚红12 mg，尿素20 g，琼脂20 g，pH值6.8。

碳酸钙沉淀培养基成分(g/L)：营养肉汤3 g，尿素20 g，碳酸氢钠2.12 g，氯化铵10 g，二水氯化钙4.9 g，琼脂20 g，pH值7.2。其中，营养肉汤(g/L)：蛋白胨5 g，氯化钠5 g，牛肉膏1.5 g，酵母粉1.5 g。

以上培养基于高压蒸汽灭菌锅中1×105Pa灭菌30 min，备用。尿素采用过滤除菌的方法，然后加入上述灭菌后的培养基。

1.2 方法

1.2.1 产脲酶细菌的筛选

本实验所用菌株分离于北戴河新河河口海洋沉积物样品[35]。将-72 ℃超低温冰箱保存的33株细菌各取1 μL，在无菌操作条件下，于牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行划线，然后将平板置于30 ℃的培养箱中倒置培养2～3 d，得到活化的菌株。

将上述活化好的33株细菌分别接种到产脲酶细菌筛选培养基，于30 ℃下培养24 h，然后进行观察。由于产脲酶细菌可通过自身所产生的脲酶催化尿素的分解而形成氨，使细菌周围出现碱性微环境，会使培养基中加入的苯酚红指示剂由浅黄变为紫红色。因此，若接种在平板中的菌落周围出现浅紫色晕圈，则该细菌为产脲酶细菌。将产脲酶细菌进行纯培养，然后用含有20%甘油的牛肉膏蛋白胨液体培养基悬浮，于-72 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 产脲酶细菌的16S rRNA基因序列分析

将产脲酶细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，于30 ℃条件下培养5 d，然后 挑取约0.1 g细菌菌落，加入1.5 mL无菌离心管中，按照DNA提取试剂盒操作步骤提取细菌基因组DNA。然后利用细菌16S rRNA基因的通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，以上述所提取的细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增[28]。扩增产物经纯化后送至康盈创新生物技术(北京)有限公司进行16S rRNA基因测序。将所测得的细菌16S rRNA基因序列在NCBI的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库中进行比对，选取与其相似性较高菌株的16S rRNA基因序列作为参照，以此确定产脲酶细菌对应属种。

1.2.3 产脲酶细菌诱导碳酸钙沉淀

选取产脲酶活性较高且属于不同属种的细菌进行诱导碳酸钙沉淀的实验。首先是细菌接种体的制备，将待测菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨平板，于28 ℃条件下，倒置培养24 h，然后将平板上的细菌菌落收集于离心管中，加入适量的无菌水，利用分光光度计调节其OD值等于1，得到接种体。

配置液体碳酸钙沉淀培养基，分别放入500 mL的三角瓶中，每个三角瓶中加入250 mL培养基，经高压蒸汽灭菌后，加入过滤除菌的尿素。然后将上述制备好的接种体按0.5%(体积比)的接种量分别接入上述液体培养基中，于30 ℃、150 rpm/min的振荡培养箱中培养5 d，直至沉淀形成。

1.2.4 沉淀的收集

液体碳酸钙培养基培养5 d后，取出三角瓶，将培养物转入50 mL离心管中，于5 000 r/min条件下离心5 min，弃上清，沉淀用去离子水洗涤3次，将沉淀物转入培养皿中自然风干，风干后的沉淀物分别用于X射线晶体衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、选区电子衍射(SAED)和傅立叶变换红外光谱(FTIR)的测试和观察。

1.2.5 X射线晶体衍射分析

取适量上述沉淀，用玛瑙研钵研磨成粉末，将粉末转入石英卡托的凹槽中，抹平，然后置于X射线晶体衍射仪(Bruker D2 PHASER)中进行测试。测试条件为：30 kV、10 mA、2θ扫描角度=10°～70°、扫描速度6 °/s。获得的X射线晶体衍射图谱用JADE 6软件进行物相检索与分析。

1.2.6 扫描电子显微镜观察

将细菌碳酸钙沉淀物胶粘在金属圆盘上，用洗耳球轻轻吹样品表面，以除去未粘牢固的碳酸钙沉淀，然后在样品表面喷Pt镀膜。将制备好的样品置于电子扫描电子显微镜(FEI Quanta 200F)下进行观察与拍照。

1.2.7 透射电子显微镜和选区电子衍射分析

将收集的细菌碳酸钙沉淀悬浮在少量水中，然后滴在电镜铜网上，待其干燥后，放入透射电子显微镜(FEI Talos F200X)，在加速电压为200 kV的条件下获得细菌碳酸钙图像及其矿物电子衍射花样。

1.2.8 傅立叶变换红外光谱分析

细菌碳酸钙表面的化学特征采用傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet Is10 FTIR)进行扫描，采用4 cm-1的分辨率，记录4 000～500 cm-1波数的光谱强度。所获得的光谱用于细菌碳酸钙表面特征的分析。

2 结果与分析

2.1 产脲酶细菌的筛选结果

33株细菌接种到产脲酶细菌筛选培养基，经过筛选得到10株产脲酶细菌(图1)，将这些菌株分别编号为CP49、CP50、CP51、CP56、CP57、CP66、CP76、CP77、CP78、CP79。接种以上菌株的菌落周围都出现了紫红色，这说明细菌已将尿素分解，致环境pH的升高，用pH试纸检测紫红色区域，pH均大于8.5；而在CP48、CP58、CP59、CP64的接种处，仍保持着培养基原来的颜色，pH试纸进一步测试表明，pH为7左右。根据菌落周围紫色范围的大小，可粗略判断出CP66产脲酶活性较高，而CP79产脲酶活性较低(表1)。

2.2 产脲酶细菌的鉴定

将10株产脲酶细菌的16S rRNA基因序列在GenBanK数据库中进行比对，结果显示：CP49、CP56、CP57三株细菌属于革兰氏阴性细菌，隶属于苍白杆菌属(Ochrobactrumsp.)，其16S rRNA基因序列分别与人苍白杆菌O.anthropi的16S rRNA基因序列的相似性为99.33%、98.09%和98.21%；另外7株细菌属于革兰氏阳性细菌，隶属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillussp.)，其中CP50、CP51、CP66、CP76、CP77 4株细菌的16S rRNA基因序列与梭形赖氨酸芽孢杆菌L.fusiformis的16S rRNA基因序列的相似性均大于98.52%，而CP78和CP79细菌的16S rRNA基因序列则与球形赖氨酸芽孢杆菌(L.sphaericus)的16S rRNA基因序列相似性较高(表1)。

表1 产脲酶细菌的16S rRNA基因序列比对结果

2.3 细菌诱导形成沉淀物的晶相分析

选取属于人苍白杆菌O.anthropicCP57和梭形芽孢杆菌L.fusiformisCP66进行诱导碳酸钙的沉淀。CP57形成的沉淀经XRD测试，其图谱中2θ角23.02°、29.40°、35.96°、39.40°、43.14°、47.49°、48.51°处出现明显的衍射峰，经JADE6软件物相检索，其分别对应于方解石(calcite)的(012)、(104)、(110)、(113)、(202)、(018)、(116)晶面(图2)，由此可断定，CP57形成的碳酸钙的物相为方解石。而CP66形成的沉淀，其XRD图谱除出现以上对应于方解石的主要衍射峰外，还在2θ角24.90°、27.05°、32.77°、42.76°、43.85°、49.19°、50.08°出现明显的衍射峰，其分别对应于球霰石(vaterite)的(110)、(112)、(114)、(008)、(300)、(304)、(118)晶面(图2)，由此断定，CP66形成的碳酸钙的晶相既有方解石又有球霰石。

2.4 细菌诱导形成碳酸钙晶体的形貌观察

在扫描电子显微镜(SEM)下，对O.anthropicCP57和L.fusiformisCP66诱导形成的碳酸钙矿物的形态特征进行对比观察(图3)。CP57所形成的碳酸钙呈现不规则状(图3(a)—(c))；CP66所形成的碳酸钙有不规则状和球形两种形貌(图3(d)—(f))，由于其XRD晶相分析既包含了方解石又包含了球霰石，再结合以上CP57的 SEM观察，推测CP66形成的沉淀中，不规则形状的碳酸钙沉淀可能为方解石(图3(e))，而球形的可能为球霰石(图3(f))。

2.5 细菌形成碳酸钙晶体的FTIR特征

O.anthropicCP57和L.fusiformisCP66形成的碳酸钙经FTIR分析，结果显示两者的图谱非常相似(图5)。细菌形成的碳酸钙都在3 434 cm-1处都出现一个明显的O—H伸缩振动峰，推测可能是碳酸钙与水分子络合造成的；两种沉淀的FTIR图谱分别在2 932 cm-1、2 878 cm-1处出现吸收峰，分别对应于脂肪族C—H的伸缩振动和C—C的伸缩振动，表明沉淀中含有有机质[36-37]；CP57的红外光谱中，1 422 cm-1、875 cm-1和711 cm-1处出的峰分别对应于方解石中CO32-基团的反对称伸缩振动、板外弯曲振动和板内弯曲振动，该峰是典型的方解石红外光谱特征[37-39]；而CP66的红外光谱中，除在1 422 cm-1、875 cm-1和711 cm-1处出现方解石的吸收峰外，还在1 081 cm-1、和743 cm-1处出现明显的吸收峰，其中1 081 cm-1对应于CO32-基团的对称伸缩振动，743 cm-1处的峰被认为是典型的球霰石的红外光谱特征[37-40]。此外，2 513 cm-1和1 798 cm-1处的峰分别是对称伸缩和反对称伸缩的联合振动、对称伸缩和板内弯曲的联合振动形成的[40]。

3 讨 论

3.1 产脲酶细菌的多样性

微生物诱导碳酸钙沉淀是近些年来土木工程与环境工程等领域研究的热点问题之一[15]，常用在建筑材料、土壤加固、水泥和混凝土保护、土壤或水体中重金属及放射性金属的治理等方面[2,7-8]。细菌诱导形成碳酸钙沉淀是自然界中普遍存在的一种现象, 目前已从于土壤、岩洞、淡水、高盐等自然环境中发现很多类型的细菌都可以诱导形成碳酸钙[10,41-46]，在这些细菌中以产脲酶细菌研究的最多，常见的产脲酶细菌有L.sphaericus、芽孢八叠球菌(Sporosarcinaginsengisoli)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、盐单胞菌(Halomonassp.)、S.pasteurii、Bacillussp.等[47]。而本研究从北戴河新河河口海洋沉积物中分离到的33株细菌中有10株能产生脲酶，产脲酶菌株所占比例达30.3%，可见海洋中也广泛存在着产脲酶细菌；并且北戴河新河河口海洋沉积物中产脲酶细菌以赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)为优势种群。

3.2 影响细菌形成不同碳酸钙晶相的因素

细菌诱导形成的碳酸钙通常有三种晶相：方解石、文石和球霰石，其中以方解石的热力学最为稳定，细菌诱导形成的三种晶相中以方解石和球霰石比较常见[2,7,23-25,48]。目前对于细菌是如何影响碳酸钙晶相的尚无定论，Ercole等[32]分别提取坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)和B.sphaericus的胞外多糖(EPS)和荚膜多糖(CPS)，体外实验均能促进方解石的形成；Tourney 和Ngwenya[49]用从地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)S-86提取的EPS实验，发现在添加EPS的体系中只生成方解石，而在含有去多糖后的细菌细胞体系中则同时形成方解石和球霰石。另外，培养基和营养条件也可能对细菌沉淀的碳酸钙晶相产生影响，Seifan等[34]的研究发现，产脲酶细菌诱导形成的碳酸钙矿物种类可能与pH值的大小有关，当pH为9～10时，球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)形成了更多的球霰石，而在pH为11～12时形成方解石；Rodriguez-Navarro等[50]报道，如果在含有醋酸钙、酪蛋白及碳酸钾的培养中添加磷酸盐(M-3P培养基)，则黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)诱导形成的碳酸钙不再仅仅含有方解石，而同时沉淀方解石和球霰石。Li等[51]对比了细菌B4培养基(含有醋酸钙、酵母粉)[41]和M-3P培养基[50]中形成碳酸钙的情况，发现L.sphaericusT5在M-3P培养里只形成方解石，而在B4培养基里能形成方解石和球霰石；而B.cereusT6虽然在两种培养基里都能形成方解石和球霰石，但在B4培养基里形成的球霰石明显增多。而本研究发现，在相同的培养和营养条件下，O.anthropicCP57的沉淀中只有方解石，而L.fusiformisCP66沉淀的碳酸钙包含了方解石和球霰石两种晶相，因此我们推测，球霰石的形成可能与菌株有关，但其机制尚需进一步研究。

3.3 细菌形成碳酸钙晶体的形貌及化学特征

前人研究表明，微生物诱导形成的碳酸钙晶体常呈现不同的形态，常见的有立方形、菱形和多边形，此外还有一些呈球形和不规则形[27]；Achal等[52]利用产脲酶细菌Halomonassp.诱导碳酸钙沉淀进行生物修复实验时，发现细菌产生的碳酸钙晶体多呈菱形；Li等[53]发现由一株Bacillussp.产生的沉淀物的晶体形态主要呈立方体、球形和多面体形状。Hammes等[14]从土壤中分离出12株细菌，发现它们在固体平板上形成的碳酸钙结晶形态不同，其形态的不同可能具有菌株特异性；不同的营养条件可能也会对细菌所形成碳酸钙的形貌产生影响，Muynck等[54]发现当以氯化钙为钙源时，细菌产生的碳酸钙主要为菱形晶体，而以乙酸钙为钙源时，则产生的碳酸钙晶体主要为球形。而Tourney 和Ngwenya[49]利用B.licheniformisS-86诱导形成的碳酸钙出现了菱形、立方形和球形等多种形态，进一步的实验证实，细菌的胞外多糖(EPS)不但能影响碳酸钙晶体的形貌，而且也会影响细菌所形成的碳酸钙晶相。而本研究在同样培养条件下，O.anthropicCP57诱导形成的碳酸钙呈现不规则状(图3(a)—(c))；而CP66诱导形成的碳酸钙则包含不规则状和球形两种形状(图3(d)—(f))，推测这可能与菌株或其产生的胞外多糖结构有关。为此我们对两株细菌产生的碳酸钙沉淀进行了FTIR表征，红外光谱特征表明两种碳酸钙沉淀均含有O—H、C—H等功能性基团，且两种光谱中均显示出方解石的特征峰，另外，L.fusiformisCP66形成的碳酸钙沉淀在红外光谱的1 081 cm-1、和743 cm-1处出现球霰石的特征峰[38]；Lv等[23]用Lysinibacillussp.GW-2同样可以诱导形成球霰石，与本研究的结果非常相似，细菌诱导形成球霰石的成因和机制目前还不清楚，有待于进一步研究。

4 结 论

本研究对北戴河新河河口海洋沉积物中产脲酶细菌进行了分离、筛选与鉴定，10株产脲酶细菌分别隶属于Ochrobactrumsp.和Lysinibacillussp.，对其中两株O.anthropicCP57和L.fusiformisCP66诱导形成碳酸钙沉淀进行了表征，在相同培养条件下，CP57菌株诱导形成的碳酸钙为方解石，呈不规则形；而CP66菌株诱导形成的碳酸钙同时包含了方解石和球霰石，其形态既有不规则形又有球形的碳酸钙，产脲酶细菌诱导形成碳酸钙矿物的晶相和形貌不同可能与菌株或其表面多糖结构有关。