乳酸菌和留茬高度对受风灾倒伏全株玉米青贮发酵品质及微生物组成的影响

杨晶晶 孙 芸 吴庆宇 王 健 张嘉宾 孙海霞 曹 阳*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室，大庆 163319；2.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心，大庆 163319；3.中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨 150081)

随着全球气候变化不断加剧，除了沿海地区频繁发生自然灾害，近年来内陆也常遭受台风、暴雨等的侵袭。2020年8月27日台风“巴威”、9月3日台风“美莎克”、9月8日台风“海神”陆续登陆黑龙江省，大多数农作物遭受台风以及强降雨的影响，全省受灾面积约为3 022万亩(1亩≈666.67 m2，绝产面积102万亩，减产面积2 920万亩)，初步估损金额27.52亿元[1]。其中，部分地区玉米发生倒伏情况严重，不同程度的倒伏不仅增加了全株玉米收割时的难度，而且严重影响了收获作物的产量和质量[2]。玉米植株遭遇倒伏之后，接触土壤，土沙本身降低饲料品质，同时泥土中生存着大量的微生物。通常1 g土壤中有几亿至几百亿个微生物，其种类和数量随土层深度的不同而变化[3]。微生物从种类上看，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类以及病毒等；从数量上来看，以细菌最多，霉菌次之，放线菌和酵母菌最少[4-6]。植株倒伏还会破坏玉米叶片在空间的正常营养分布，引起叶片部分的光合速率迅速下降，阻碍水分和养分从根系到叶片部分的输送，进而影响了从叶片到果穗部分光合产物的运输[7-8]。如果茎秆发生较为严重的倒折情况，就会造成伤口及以上部分植株死亡，籽粒灌浆和光合速率停止，玉米产量急剧下降甚至造成绝收[9-11]。风灾倒伏玉米多数水分含量比较高，不及时收获容易发生腐烂，造成粗饲料资源浪费。青贮是将青绿多汁饲料进行充分的压实密封，使其与外部空气隔绝形成厌氧环境，促进青绿饲料发酵以达到长期保存的目的，是减少青绿饲料营养成分损失最主要和应用最为广泛的方法之一[12]。青贮后的全株玉米能值高、易消化、适口性好，已成为反刍家畜饲粮中主要成分[13]。因此，最经济可行的措施是将倒伏全株玉米调制成青贮饲料，以供草食家畜食用。

本试验通过对倒伏与直立玉米植株、添加乳酸菌和不同留茬高度对其营养成分、青贮发酵品质以及附着微生物展开研究，探索各指标的内在关系，明确倒伏玉米最优的青贮条件，为提高粗饲料的利用率、生产高品质安全的倒伏全株玉米饲料产品以及为其他受灾倒伏玉米青贮调制提供科学的理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

对黑龙江省大庆市大同区、让胡路区和红岗区3个地点的倒伏及直立蜡熟期全株玉米分别进行采样，玉米品种均为中原单32。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)制剂(日本雪印种苗株式会社生产)由日本国立畜产草地研究所提供，活菌数为109CFU/g，使用方法和剂量依据其包装说明书。

1.2 试验设计

原料指标采用两因素(2受灾状况×4留茬高度)、青贮饲料指标采用三因素(2受灾状况×2添加×4留茬高度)完全随机试验设计，倒伏、直立(对照)全株玉米留茬高度为10、20、30和40 cm，将样品切碎至2～3 cm，各处理茎秆、叶、籽实充分混合均匀，并进行植物乳杆菌制剂添加和无添加处理。植物乳杆菌制剂的添加方法为菌粉与无菌水按1∶400比例混合均匀配制成菌液，并将菌液按1∶100比例添加于青贮原料中，即菌剂最终添加量为0.000 25%。以上各处理分别称重200 g，然后装入聚乙烯包装袋(160 mm×250 mm)中进行真空密封包装，每个处理设定3个重复，于室温[(24±2)℃]条件下贮藏30 d后，取样测定分析相关指标。

1.3 指标测定

1.3.1 感官品质评定

参照青贮饲料质量评定标准[14]，对开袋后各处理的全株玉米青贮样品的颜色、气味、质地以及有无霉变等方面进行感官品质评价。

1.3.2 常规营养成分指标

将开袋后的各处理全株玉米青贮样品置于电热恒温鼓风干燥箱(DGG-9240B型，上海森信实验仪器有限公司)中恒重(65 ℃)。采用微型植物破碎机(FZ-102型，临沂正衡华玻仪器有限公司)将样品粉碎至0.5 mm备用。参照AOAC(1990)[15]的方法，采用电热恒温鼓风干燥箱测定样品中干物质(DM)含量，采用自动凯氏定氮仪(K1100F，济南海能仪器股份有限公司)测定样品中粗蛋白质(CP)含量，采用索氏提取器测定样品中粗脂肪(EE)含量，采用马弗炉(SX2-4-10，天津中环实验电炉有限公司)测定样品中有机物(OM)含量。参照Van Soest等[16]的方法，采用纤维分析仪(ANKOM A200i，北京安科博瑞科技有限公司)测定样品中中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量。

1.3.3 发酵品质测定

取10 g各处理青贮样品置于聚乙烯袋中，加入90 mL灭菌蒸馏水，用均质器(BAGMIXER-400W，Interscience，法国)拍打90 s直至充分混匀[17]。采用便携式pH计(FG2-FK型，上海巴玖实业有限公司)对浸提液的pH进行测定。取部分浸提液进行过滤，滤液经高速冷冻离心机(6 500×g、4 ℃)离心5 min，再经0.22 μm滤膜过滤。参照Cao等[18]的方法，采用高效液相色谱仪(LC-100)分析测定乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)以及丁酸(BA)的含量。

1.3.4 微生物数量分析

采用平板计数法对各处理全株玉米青贮中乳酸菌(lactic acid bacteria)、芽孢杆菌(Bacillus)、好氧性细菌(aerobic bacteria)、酵母菌(yeast)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、霉菌(mold)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)进行计数[19]。取10 g样品装入聚乙烯包装袋中，加入90 mL无菌蒸馏水，利用均质器(BAGMIXER-400W，Interscience，法国)均质90 s，并进行连续倍数梯度稀释(10、102、103、104和105倍)。取稀释后的浸提液20 μL，滴加到提前预备的培养基上。乳酸菌和丁酸梭菌分别使用MRS琼脂培养基和强化梭菌鉴别琼脂培养基(青岛海博生物科技有限公司)，置于厌氧培养箱(30 ℃、48 h)中培养；酵母菌和霉菌使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、大肠杆菌使用浅蓝肉汤琼脂培养基、好氧性细菌和芽孢杆菌使用标准琼脂培养基(Nissui Ltd.，日本)，置于恒温培养箱(30 ℃、48 h)中培养。在培养芽孢杆菌和丁酸梭菌前，需将浸提液在75 ℃水浴15 min。经过培养后的微生物在适当稀释倍数产生30～300个菌落的情况下，进行菌落计数，并用对数lg(CFU/g FM)(FM表示鲜物质基础)表示菌落数。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2019对试验数据进行汇总和整理，原料指标采用两因素、青贮饲料指标采用三因素完全随机设计，使用SPSS 23.0统计软件中一般线性模型(GLM)对试验数据进行方差分析，并用Duncan氏法对平均值进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示。P<0.01为极显著水平，P<0.05为显著水平。

2 结果与分析

2.1 留茬高度对倒伏与直立全株玉米原料中营养成分及微生物组成的影响

由表1可知，青贮前，倒伏组全株玉米原料中NDF和ADF含量略高于直立组(P>0.05)，而DM、CP以及EE含量则低于直立组(P>0.05)，其中，倒伏玉米在留茬30 cm时CP含量最高。不同留茬高度对玉米NDF含量也有影响，倒伏组留茬10 cm时显著高于留茬30和40 cm时(P<0.05)，倒伏组留茬20 cm时显著高于留茬40 cm时(P<0.05)，直立组留茬10和20 cm时均显著高于留茬30和40 cm时(P<0.05)。

表1 留茬高度对倒伏与直立全株玉米原料中营养成分的影响

由表2可知，随着留茬高度的增加，直立组全株玉米原料中酵母菌数量显著增加(P<0.05)，并且在留茬40 cm时显著高于倒伏组(P<0.05)，所有玉米原料均未发现芽孢杆菌、丁酸梭菌以及霉菌，受灾状况和留茬高度对酵母菌数量有显著交互作用(P<0.05)。

表2 留茬高度对倒伏与直立全株玉米原料中微生物组成的影响

2.2 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮感官品质的影响

由表3可知，全株玉米青贮均无霉变，大多呈黄绿色，除倒伏和直立30 cm留茬及添加处理有较浓的酸香味外，其余各处理均为适宜酸香味，且茎叶柔软、湿润。

表3 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮感官品质的影响

2.3 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮营养成分的影响

由表4可知，倒伏组玉米青贮CP含量低于直立组，其中倒伏组10和20 cm留茬处理显著低于直立组(P<0.05)。添加乳酸菌后，玉米青贮DM含量高于无添加处理，其中倒伏组20 cm留茬及添加处理显著高于无添加处理(P<0.05)；倒伏组10和20 cm留茬及添加处理CP含量均显著高于无添加处理(P<0.05)。随着玉米留茬高度的增加，玉米青贮CP含量显著提高(P<0.05)，其中倒伏组30和40 cm留茬及无添加处理显著高于10和20 cm留茬及无添加处理(P<0.05)，直立组40 cm留茬及添加处理显著高于10 cm留茬及添加处理(P<0.05)。倒伏组10和20 cm留茬处理(添加和无添加)玉米青贮NDF含量均显著高于30和40 cm留茬处理(P<0.05)；直立组10 cm留茬处理(添加和无添加)NDF含量显著高于30和40 cm留茬处理(P<0.05)，并且20 cm留茬处理显著高于40 cm留茬处理(P<0.05)；倒伏组10 cm留茬及添加处理玉米青贮OM含量显著低于30和40 cm留茬及添加处理(P<0.05)。

表4 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮营养成分的影响

2.4 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮发酵品质的影响

由表5可知，倒伏组玉米青贮LA含量低于直立组，其中20、30和40 cm留茬处理均显著低于直立组(P<0.05)；倒伏组30和40 cm留茬处理玉米青贮AA含量均显著低于直立组(P<0.05)。添加乳酸菌后，玉米青贮pH显著降低(P<0.05)，而LA含量提高，其中直立组20和30 cm留茬处理均显著高于无添加处理(P<0.05)。不同留茬高度对玉米青贮LA含量也有影响，其中倒伏组10 cm留茬及添加处理玉米青贮LA含量显著高于30和40 cm留茬及添加处理(P<0.05)；直立组40 cm留茬及无添加处理玉米青贮LA含量显著高于20和30 cm留茬及无添加处理(P<0.05)，直立组30 cm留茬及添加处理玉米青贮LA含量显著高于40 cm留茬及添加处理(P<0.05)。倒伏组10 cm留茬及添加处理玉米青贮AA含量显著高于30和40 cm留茬及添加处理(P<0.05)。所有玉米青贮均未检测出BA，乳酸菌添加和留茬高度对玉米青贮LA含量有显著交互作用(P<0.05)。

表5 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮发酵品质的影响

2.5 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮微生物组成的影响

由表6可知，倒伏组30 cm留茬及添加处理玉米青贮乳酸菌数量显著高于无添加处理(P<0.05)，直立组20和30 cm留茬及添加处理玉米青贮酵母菌数量均显著低于无添加处理(P<0.05)，而直立组20 cm留茬及添加处理玉米青贮大肠杆菌数量显著低于无添加处理(P<0.05)，所有玉米青贮均未发现芽孢杆菌、丁酸梭菌和霉菌。

表6 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮微生物组成的影响

3 讨 论

3.1 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮感官品质的影响

优质青贮的颜色接近原料的色泽，酸香气味，可见清晰的茎叶结构，湿润不黏手[20]。杨丽萍等[21]认为添加微生物制剂的试验组青贮气味及色泽优于对照组。本试验得出，不同留茬高度对倒伏及直立全株玉米青贮感官品质影响不大。赵雪娇[22]、李明超[23]也得出不同留茬高度对玉米青贮感官品质没有影响，与本试验结果一致。

3.2 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮营养成分的影响

全株玉米青贮的营养成分是判定玉米青贮品质优劣的重要指标之一。青贮能很好地保存饲料的CP，增强动物的适口性，优质的青贮玉米DM及CP含量较高，而纤维含量较低[24]。本试验得出，玉米受灾状况对其营养成分有一定的影响，倒伏玉米原料DM、CP含量低于直立玉米，青贮后的倒伏玉米CP、DM以及NDF含量均低于直立玉米，而ADF含量高于直立玉米。这说明玉米发生倒伏后其营养价值降低，原因可能是玉米植株倒伏阻碍了水分和营养物质在体内的运输，从而影响收获玉米的产量及质量。

添加剂可以减少全株玉米青贮过程中营养物质的损耗。本试验中，添加乳酸菌后玉米青贮NDF和ADF含量低于无添加处理，而CP含量高于无添加处理，说明添加乳酸菌可以降低粗纤维含量，提高CP含量，这与张相伦等[24]、毛翠等[25]和Li等[26]的研究结果一致。

王丽学等[27]认为全株玉米收割时的留茬高度一般为15～30 cm。留茬过低或过高均会影响玉米青贮的效果，当留茬过低收割时，尘土容易被带入进去，引起梭菌等有害微生物大量增殖，致使青贮玉米发酵品质差，营养成分流失严重；不过，虽然较高的留茬高度能够提升玉米的青贮品质，但这会使可收获生物量下降，此时种植利益就难以得到保障[28-29]。本试验中，倒伏玉米原料在留茬30 cm时CP含量最高；青贮后在留茬30 cm时ADF含量最低，并且CP含量显著高于留茬20 cm时，NDF含量显著低于留茬20 cm时。这表明，随着留茬高度的增加，CP含量提高，NDF和ADF含量则表现为降低趋势，这与王丽学等[27]、王永军等[30]、Neylon等[31]和Oba等[32]的研究结果一致。

3.3 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮发酵品质的影响

有机酸的含量是反映青贮饲料品质优劣的另一个重要指标，其中LA、AA和BA的含量最为重要[33]。研究表明，含有大量的LA、少量AA和不含有BA是优质青贮饲料的共同特点[33]。本试验中，青贮后倒伏玉米pH高于直立玉米，LA、AA含量均低于直立玉米，且添加乳酸菌后pH降低，LA、AA含量提高；而对于不同的留茬高度，各指标含量没有明显变化趋势，且均未检测出BA，这与李文才等[28]、Neylon等[31]和董起飞[34]的研究结果一致。

3.4 乳酸菌和留茬高度对倒伏与直立全株玉米青贮微生物组成的影响

在青贮过程中，主要包括的微生物有乳酸菌、好氧性细菌、酵母菌以及霉菌[22]。乳酸菌是一种重要的益生菌，当pH降到4以下时，乳酸菌开始大量繁殖，最终维持在107数量级[35]。本试验中，青贮后倒伏玉米乳酸菌数量低于直立玉米，在留茬30 cm时乳酸菌较多，好氧性细菌和大肠杆菌等有害菌数量较少，且在添加乳酸菌后，好氧性细菌以及酵母菌数量减少，而乳酸菌数量明显增加，这与杨云贵等[36]、陆永祥等[37]的研究结果一致。添加乳酸菌降低了青贮体系内的pH，从而抑制有害菌的生长活动，大部分青贮饲料中乳酸菌数量都不充足，因此乳酸菌制剂就成为一种很重要的微生物菌种添加剂，添加适当的剂量能够有效提高青贮品质，而且无毒、无腐蚀性，对环境不造成危害，比化学添加剂更容易被人们所接受[38-39]。

4 结 论

本试验条件下，在倒伏玉米植株上没有发现霉菌，添加乳酸菌制剂可以改善倒伏全株玉米的青贮品质、减少营养成分损失；同时，倒伏全株玉米留茬高度为30 cm左右会收获较高品质的青贮饲料。