枇杷果肉颜色调控关键基因PSY2A的分子标记开发与应用

宋海岩，孙淑霞，陈 栋，李 靖，涂美艳，徐子鸿，娄红霞，龚荣高 *，江国良 *

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.四川省农业科学院园艺研究所＆农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，成都 610066）

枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）是原产于我国四川大渡河流域的特色水果，其果实甜酸适口、柔软多汁，受到世界各国消费者的喜爱。枇杷品种丰富多样，生产上常依据果肉颜色将枇杷品种划分为黄肉枇杷和白肉枇杷两种类型[1]。黄肉枇杷果肉较紧密，果皮较厚，较耐贮运，抗逆性强，平均单果重较大，而白肉枇杷肉质细嫩、汁多味甜，因其风味好、口感佳而更受消费者的青睐[2]。

果实颜色的形成主要依赖于果肉中色素的积累，其中类胡萝卜素是成熟枇杷果实的主要呈色色素[3]。黄肉枇杷的果皮和果肉以及白肉枇杷的果皮可以正常地积累类胡萝卜素，而白肉枇杷的果肉不积累或者仅积累少量的类胡萝卜素从而导致其果肉呈现白色[4]。遗传分析显示枇杷果肉颜色中黄肉为显性性状，而白肉为隐性性状[5-6]。Fu X.等[7]的研究结果显示黄肉和白肉枇杷品种间类胡萝卜素生物合成基因的表达差异并不能很好地解释两类枇杷品种间类胡萝卜素含量的巨大差异。八氢番茄红素合成酶（Phytoene synthase）是类胡萝卜素生物合成途径中的关键限速酶，极大地影响植物类胡萝卜素的积累[8]。Fu X.等[8]进一步的研究结果显示枇杷品种白沙（白肉）由于EjPSY2A基因在3’端发生大片段的缺失导致八氢番茄红素合成酶失活从而致使类胡萝卜素无法正常合成和积累；而洛阳青（黄肉）的EjPSY2A基因的序列正常，可以正常合成并积累类胡萝卜素。

与传统育种方法相比，分子标记辅助育种（MAS）提供了一种高效和精准的选育优良品种的方法[9]。与目的性状连锁的分子标记的开发是开展分子标记辅助育种的前提。插入和缺失多态性标记是一类重要的分子标记，具有共显性、广泛分布、可重复性以及高效性等特点而深受欢迎[10]。InDel标记已经成功地在水稻、玉米、小麦以及园艺作物中使用[11-14]。为加速不同果肉颜色类型枇杷优良品种的选育，我们基于不同果肉颜色枇杷品种间的EjPSY2A基因序列差异开发一个InDel分子标记，并选择具有代表性的29个选育品种、19个地方品种、14个引进品种、4份野生种质资源和19份杂交后代对其鉴定效果进行验证。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料包含中国9个省、市和自治区以及西班牙、意大利、美国和日本等国家共收集85份枇杷种质资源以及项目组创制的杂交后代，其中42份材料为黄肉枇杷，43份材料为白肉枇杷，覆盖世界上枇杷种质资源分布的大部分区域（表1）。所有枇杷供试材料种植于四川省农业科学院现代农业科技创新示范园（北纬30°46'47″，东经104°12'28″，海拔489 m），园区内枇杷品种资源树龄6～8年，株行距3 m×5 m，疏散分层型，采取常规田间管理措施。果实完熟期观察每个品种的果肉颜色并拍照记录。收集各个品种枇杷的幼嫩叶片用于DNA提取以及后续的基因分型工作。

1.2 引物设计和基因分型

基于Fu X.等[8]的研究结果，白肉枇杷品种的EjPSY2A基因序列在3’端有694 bp碱基的缺失，我们在EjPSY2A基因InDel位点两侧设计引物用于InDel位点的扩增和分型（表1）。改良CTAB法用于枇杷基因组DNA的提取，使用液氮和研钵将新鲜嫩叶磨成粉并转入2.0 mL离心管中，加入600 μL 65℃预热的CTAB提取液，混匀后65℃水浴30 min，中途混匀2次；加入350 μL 25∶24∶1的酚︰氯仿︰异戊醇抽提液，离心；上清液转入新的1.5 mL离心管，加入等体积预冷的异丙醇，离心；倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇漂洗；自然风干沉淀，加入TE溶液溶解DNA。使用NanoDrop one微量紫外可见分光光度计检测DNA浓度和质量，备用。PCR反应体系：1.0 μL DNA 模 板 ，12.5 μL 2×PCR Mix（擎科），1.0 μL 10 μM正反向引物，加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序：94℃预变性4 min，95℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环35次，最后72℃延伸10 min。使用1%的琼脂糖凝胶电泳和8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物进行基因分型。

表1 基于枇杷EjPSY2A基因设计的果肉颜色分子标记引物Table 1 The primers of the molecular marker for flesh color based on EjPSY2A gene in loquat

1.3 InDel分子标记的验证

首先选用10份黄肉和10份白肉枇杷种质资源对基于EjPSY2A基因新设计的2对InDel分子标记引物进行初步验证和筛选，然后使用选定的引物对85份枇杷种质资源与杂交后代进行PCR扩增和基因分型，对分子标记的准确性进行最终的验证。

1.4 TA克隆

为检测PSY2A基因的InDel引物扩增片段的正确性，我们对PCR产物进行TA克隆并测序。PCR产物经琼脂糖电泳后对目标片段进行切胶回收，连接至TA克隆载体pClone007 vector，反应体系为：1 μL PCR 回收产物，1 μL pClone007 vector，1 μL 10×Topo Mix（擎科）和7 μL ddH2O，室温反应5 min。连接产物继续使用TreliefTM5α（擎科）进行大肠杆菌转化，每一个目的片段挑取1个阳性克隆进行测序，测序结果与PSY2A基因的参考序列进行比对[8]。

2 结果与分析

2.1 果肉颜色鉴定

为鉴定85份供试枇杷材料的果肉颜色，我们于2020年5月枇杷果实完全成熟时观察果肉的颜色，每个材料至少选取10个以上完全成熟的果实观察并拍照记录。观察结果显示，85份供试材料中42份材料的果实为黄肉，43份材料的果实为白肉（表2），部分枇杷品种的果肉颜色如图1。

图1 完熟期枇杷果皮及果肉颜色Figure 1 The color of fruit and flesh in loquat at full ripen stage

（续 表2）

2.2 InDel分子标记的开发

为通过分子标记鉴定不同果肉颜色的枇杷，我们基于已公布的枇杷PSY2A基因（GenBank accession numbers KF922364）的序列设计了2对InDel分子标记的引物（表2）。首先，我们选取了20份枇杷材料（10份黄肉材料和10份白肉材料）对两对InDel引物的扩增效率以及条带清晰度进行检验，结果显示两对InDel引物均能扩增出目的条带，且两对引物对同一品种扩增出来的带型一致（图2）。所有白肉枇杷材料扩增小片段纯合带型，表明基因型为纯合EjPSY2Ad。黄肉枇杷材料中Y1艳红、Y3大五星扩增出来大片段纯合带型，表明这3个样品的基因型为纯合EjPSY2A，无法扩增出EjPSY2Ad的片段，未发生基因的大片段缺失，其余黄肉材料均为杂合带型，为EjPSY2A和EjPSY2Ad的杂合基因型。在试验过程中，我们发现第二对InDel引物PSY2A-2扩增出来的条带更清晰（图2），但PSY2A-2引物扩增的大片段依然不够明显，因此在后续的试验中我们计划改用聚丙烯酰胺凝胶电泳对PSY2A-2开展进一步验证。

图2 使用两对新设计的InDel引物对10份黄肉和10份白肉枇杷材料PCR扩增结果Figure 2 The PCR amplifications of 10 yellow-fleshed and 10 white-fleshed loquats with two new InDel primers.

2.3 InDel分子标记的验证

为进一步验证InDel分子标记对枇杷果肉颜色鉴定的准确性，我们继续使用第二对InDel引物PSY2A-2对85份枇杷供试材料进行PCR扩增和基因分析。分型结果显示所有43份白肉枇杷材料均为小片段纯合带型，表明所有白肉枇杷的基因型为纯合EjPSY2Ad（图3）。42份黄肉枇杷材料中，有3个黄肉枇杷选育品种（Y1艳红、Y3大五星、Y39洛阳青）、2个杂交后代（Y19 CB5-2、Y20 CB10-14）、1个引进品种（Y30田中）、1个地方品种（Y36台湾恒春）以及2份野生枇杷种质资源（Y37椭圆枇杷和Y41大花枇杷）为大片段纯合带型，基因型为纯合EjPSY2A；其余33份黄肉枇杷材料和杂交后代均为大片段和小片段的杂合带型，同时具有EjPSY2Ad和EjPSY2A等位基因。验证结果显示小片段纯合带型材料的果实为白肉，而大片段纯合带型以及大片段与小片段杂合带型材料的果实为黄肉，表明该InDel分子标记可以有效地把黄肉和白肉枇杷种质资源和杂交后代区分开来，可用于枇杷果肉颜色的分子标记辅助育种。

图3 InDel分子标记对43份白肉枇杷材料的分型结果Figure 3 The genotyping result of 43 white-fleshed loquats with InDel molecular marker

2.4 TA克隆验证

为了验证InDel引物扩增位点的正确性，我们使用TA克隆的方法对目的片段进行测序。白肉枇杷材料W3 TBW、W5新白8号和W11贵妃的单一扩增片段测序结果与EjPSY2A参考基因组序列相比，在EjPSY2A基因的2 296～2 989 bp处有694 bp的大片段缺失，为EjPSY2Ad等位基因（图5）。黄肉枇杷品种Y1艳红的单一扩增片段的测序结果与EjPSY2A参考基因组序列完全一致，为EjPSY2A等位基因。黄肉枇杷品种Y3大五星的单一扩增片段的测序结果显示在2 296～2 989 bp处未发生694 bp的大片段缺失，但是在2 942～2 947 bp处有6个碱基的缺失（图5）。黄肉枇杷材料Y8 TBY的目的片段有两条，其中小片段的测序结果与白肉材料W3 TBW、W5新白8号和W11贵妃完全一致，有694 bp的大片段缺失，为EjPSY2Ad等位基因；而大片段的测序结果与参考基因组序列基本一致，无694 bp的大片段缺失，但是在2 800 bp处有一个T→C的SNP（图5）。

3 讨论和结论

果肉颜色是农业生产中受到重点关注的一个农艺性状，也是园艺作物吸引消费者的重要基础[15]。根据果肉颜色，枇杷可以分为黄肉和白肉品种两种类型[1]。不同果肉颜色的枇杷品种在果皮厚度、耐储运度、果肉口感以及产量等农艺性状上有一定的差异[2]。枇杷实生苗童期长达5年左右，传统杂交育种方法筛选枇杷优株的时间非常漫长，基于分子标记的辅助育种法可以极大地缩减枇杷的育种周期，加速品种改良进程，提高育种效率[16]。因此，开发与果肉颜色连锁的分子标记有助于加速不同果肉颜色类型枇杷的育种速度。本研究基于枇杷类胡萝卜素生物合成关键基因八氢番茄红素合成酶基因（EjPSY2A）在黄肉和白肉品种间的序列差异，开发插入缺失（InDel）分子标记，并选择全世界范围内具有代表性的枇杷种质资源与杂交后代进行验证。

八氢番茄红素合成酶是类胡萝卜素生物合成途径中的关键限速酶，对植物类胡萝卜素的合成和积累具有重要作用[8]。白肉品种‘白沙’和黄肉品种‘洛阳青’在EjPSY2A基因3’端有一段大片段的插入缺失（InDel）[8]。本试验基于白肉品种‘白沙’和黄肉品种‘洛阳青’的序列差异开发2对InDel分子标记，经初步筛选后选取分型结果清晰的引物PSY2A-2对该InDel分子标记的准确性进行验证，并扩大验证材料数量至85份国内外枇杷种质资源及杂交后代。结果显示，所有43份白肉枇杷材料带型为纯合的小片段，而所有黄肉枇杷至少有一条大片段，其中33份黄肉枇杷带型杂合带型，另有9份黄肉枇杷材料的带型为纯合大片段。因此根据带型可以将黄肉和白肉枇杷准确地区分开来。

Fu X.等[8]的研究结果显示黄肉枇杷品种‘大五星’的EjPSY2A位点为杂合状态，同时具有大片段的EjPSY2A等位基因和小片段的EjPSY2Ad等位基因。然而，本试验中基因分型结果显示‘大五星’枇杷在EjPSY2A基因位点处为纯合状态，仅有大片段的EjPSY2A等位基因（图4）。为进一步验证不同果肉颜色枇杷EjPSY2A位点扩增片段的正确性，我们通过TA克隆的方法证实了PSY2A-2引物扩增的位点确实是枇杷EjPSY2A基因，白肉枇杷材料为纯合小片段，在3’端有一段694 bp的碱基缺失，为EjPSY2Ad等位基因；黄肉枇杷为纯合大片段或者杂合带型，至少有一个正常的EjPSY2A等位基因（图5）。本试验研究结果同时证实了枇杷果肉颜色性状中黄肉相对白肉是显性性状，这与许家辉、邹士成等[5-6]的结论一致。

图4 InDel分子标记对42份黄肉枇杷材料的分型结果Figure 4 The genotyping result of 42 yellow-fleshed loquats with InDel molecular marker

综上所述，本研究基于枇杷类胡萝卜素生物合成关键基因EjPSY2A在黄肉和白肉枇杷品种间的序列差异，开发了一个InDel分子标记，可以准确地将黄肉和白肉枇杷种质资源以及杂交后代区分开来，准确率达100%。该标记可以用于不同果肉颜色枇杷新品种选育，对指导枇杷杂交后代早龄选择育种具有重要意义。