盖草能在胡麻种植中的安全施用及其靶标基因AccA的表达分析

赵丽蓉，李雯，张建平*，刘自刚，齐燕妮，李闻娟，谢亚萍

（1.甘肃农业大学农学院，甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质资源创新重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院作物研究所，甘肃 兰州 730070）

胡麻（Linumu usitatissimum L.）属于亚麻科亚麻属，自花授粉，是一年生草本植物（2n＝2x＝30）。胡麻作为我国西北和华北地区主要的油料及经济作物，具有耐旱、耐寒、耐瘠薄等特点［1-2］。

杂草防除是胡麻种植工作中的一个重要环节，杂草若不及时除掉很容易形成草荒，造成减产。胡麻多采用窄行密植栽培，而且生育期杂草种类多、数量大，难以进行中耕除草，且人工除草成本高、费时费力。近年来化学除草剂已经在胡麻种植中得到广泛应用，对胡麻的高产稳产起到了巨大的作用［3］。使用除草剂对杂草进行化学防治，具有高效、经济、省力等优点。在实际生产中，人们往往关注的是除草剂的除草效果，而忽视了其对作物的危害，若除草剂使用浓度和方法不当，会使作物产生药害，造成严重的经济损失［4-5］。

乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂类除草剂具有高效低毒、施用期长、对后茬作物安全等优点，其作用原理是通过抑制ACCase的羧化反应，使植物脂肪酸合成受到抑制，导致细胞膜的完整性遭到破坏，造成相关代谢产物渗漏，最终导致植物死亡［6］。盖草能属于ACCase抑制剂类除草剂，对禾本科杂草具有极强的防效功能，在全世界范围内广泛使用。在我国，高效盖草能已有多年的使用历史，主要用于油菜、棉花、大豆、油葵、红花、甜菜、亚麻、瓜类、苜蓿、甘草、胡萝卜、葱、蒜、薯类、蔬菜等多种阔叶作物［7］。虽然对其产生抗性的杂草至今尚未有相关的报道，但长期单一使用，会导致杂草对盖草能的敏感性逐渐下降，而除草剂用量的加大会对作物生长发育造成一定的影响［8］。胡麻是双子叶植物，具有异质型ACCase，对盖草能有一定的抗性。本研究采用盖草能对陇亚14号进行处理，评价盖草能不同处理下陇亚14号的安全性，结合盖草能靶标基因AccA的表达，旨在为科学合理使用盖草能提供理论依据，为进一步培育抗盖草能胡麻种质资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试胡麻品种陇亚14号由甘肃省农业科学院作物研究所胡麻课题组提供。供试材料于2021年3月种植于甘肃省农业科学院兰州试验基地（36°03′N，103°40′E，海拔1500m），出苗后30 d对胡麻幼苗进行盖草能处理。

1.2 盖草能处理与样品采集

供试药剂为10.8%盖草能乳油（高效氟吡甲禾灵），美国陶氏益农公司生产。配制3种不同浓度的盖草能药剂（5、10、15 mL/L），用3种浓度的盖草能分别对陇亚14号幼苗进行喷雾处理，每种浓度均匀喷雾一次，用量为80 mL。盖草能处理的同时取未施药的陇亚14号叶片作为对照，在盖草能处理后3 h、6 h、24 h、7 d分别采集3种不同浓度处理的陇亚14号叶片，所有采取的样品用液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱备用。

1.3 组织样总RNA提取及cDNA合成

用试剂盒Plant Easy Spin RNAMiniprep Kit（BIOMIGA，USA）提取各样品RNA，随后利用NanoDrop 2000分光光度计和凝胶电泳对RNA的浓度和纯度进行检测。用试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kitwith gDNA Eraser（Perfect Real Time；TaKaRa）去除基因组DNA并合成cDNA，检测其浓度和质量后保存于-20℃冰箱用于qRT-PCR分析。

1.4 实时荧光定量PCR

根据胡麻AccA基因CDS序列，利用Primer 5.0软件设计荧光定量引物（表1）。以GAPDH为内参基因，使用2×SYBR Mixture（Biomiga）荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR。PCR反应体系为20μL：2×SYBR Mixture 10μL、正向引物（10μmol/L）1μL、反向引物（10μmol/L）1μL、cDNA模板（100 ng/μL）2μL、无 RNase水 6μL。PCR反应条件：50℃ 2 min、95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃15 s、72℃ 15 s，40个循环；95℃ 15 s、65℃ 1min、97℃ 1 s。每个样品3次重复。运用2-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达量［9］，最后利用Microsoft Excel 2019软件作图。

表1 荧光定量引物Table 1 Fluorescent quantitative primers

2 结果与分析

2.1 盖草能处理对胡麻幼苗的影响

施用盖草能后分别在3 h、6 h、24 h和7 d观察不同处理下胡麻幼苗的形态变化，发现不同处理的盖草能对胡麻幼苗的损伤程度随时间发生不同程度的变化（图1）。与对照相比，施药3 h后，喷施5 mL/L盖草能的胡麻幼苗少量叶片出现模糊的条状浅斑，植株整体未出现萎蔫，茎部正常，未发生药害，生长状况良好；喷施10 mL/L盖草能时多数叶片发生药害，出现条状浅斑，叶片无萎蔫干枯，植株茎部下段发生轻微药害，植株总体生长状态良好；喷施15 mL/L盖草能的植株叶片多数出现深色药害斑块，少数下部叶片变黄，茎下部出现轻微药害，有浅色条斑但并不明显，生长状态良好。施药6 h后，喷施5 mL/L和10 mL/L盖草能时少量植株药害加强，叶片表面斑块颜色加深，但整体叶片颜色仍保持绿色，生长未受到明显影响，与施药3 h的表现无明显差异；喷施15 mL/L盖草能时植株多数叶片尖部出现干枯，叶片表面药害条斑扩散为片状，少数叶片甚至出现萎蔫，蜷缩。施药24 h后，喷施5 mL/L盖草能的植株少数叶片药害减轻，叶片表面的条状浅斑部分消失，植株进入药害恢复阶段；喷施10 mL/L盖草能的植株少数叶片表面药害形成的条斑由1条增至2～3条，极少数矮小植株顶部叶片大面积受到药害，茎部条斑颜色明显加深；喷施15 mL/L的植株叶片绝大多数发生药害，多数叶片干枯蜷缩，植株萎蔫严重，茎部整体受损严重，出现褐色片状斑。施药7 d后，喷施5 mL/L盖草能的植株已完全恢复正常生长，与对照无明显差别；喷施10 mL/L盖草能的植株少数叶片仍有干枯，但植株茎部基本恢复正常，药害有明显缓解，植株进入恢复阶段；喷施15 mL/L盖草能的植株部分叶片干枯发黄，植株茎部药害斑减轻减少，药害植株仅有轻微的恢复。与对照相比，喷施5 mL/L盖草能的胡麻植株恢复后与对照无明显差异，喷施15 mL/L盖草能的胡麻植株受药害较为严重，而喷施10 mL/L盖草对植株虽有药害但基本可以恢复正常生长。对处理后不同时间的植株高度分析发现（图2），喷施15 mL/L盖草能药剂的植株较其他两个处理矮。

图1 盖草能不同处理后胡麻幼苗形态变化Fig.1 Morphological changes of flax seedlings after spraying different treatments of haloxyfop-r-methyl

图2 盖草能不同处理后植株株高Fig.2 Plant height of flax under different treatments of haloxyfop-r-methyl

2.2 盖草能处理后植株的枯萎率

对3种不同浓度盖草能处理下植株的枯萎率进行分析（图3），结果表明，5 mL/L盖草能处理下，其在各时段枯萎率均为0，说明在此浓度下，植株生长状况良好，无枯萎植株；10 mL/L盖草能处理下，随着时间变化植株枯萎率呈先增后减趋势，分别为0、10%、30%、25%，说明在此浓度下，植株前期受药害严重导致枯萎植株增加，在处理后7 d，部分枯萎植株恢复正常生长，植株整体进入恢复阶段；15 mL/L盖草能处理下，植株枯萎率持续增长，分别为0、15%、45%、60%，说明植株一直处于药害阶段，难以恢复正常生长。

图3 盖草能不同处理后植株枯萎率Fig.3 The withering rate of plants after spraying different treatments of haloxyfop-r-methyl

2.3 盖草能胁迫下AccA基因表达分析

在盖草能处理后不同时期采集叶片，通过qRT-PCR分析其靶标基因AccA的表达模式。由图4可知，AccA在所采集的13个样品中均有表达，且在喷施15 mL/L盖草能后24 h的叶片中表达量明显高于其他处理的叶片。随着时间的变化，AccA的表达量总体呈先增后减的趋势，且均在处理后24 h时表达量达到最高。在盖草能处理后6 h和24 h时，AccA基因表达量因盖草能浓度不同而不同，呈现为 15 mL/L＞10 mL/L＞5 mL/L，均在喷施 15 mL/L时表达量最高，且 24 h时表达量差异更加显著。

图4 盖草能胁迫下AccA基因的表达分析Fig.4 Expression analysis of AccA under haloxyfop-r-methyl stress

2.4 相关性分析

相关性分析结果表明，药剂浓度与植株枯萎率呈显著正相关（p＜0.05），相关系数为0.624；处理时间与株高呈极显著正相关（p＜0.01），相关系数为0.963；其余各性状间不相关或是相关性不显著（表 2）。

表2 相关性分析Table 2 Correlation analysis

续表2

3 讨论

杂草对农业可持续发展造成严重威胁［10］。有研究［11-12］表明，施用化学除草剂可以有效抑制杂草生长，从而提高作物的产量，但化学除草剂对于作物而言是一种胁迫因子，过量施用也会导致作物生长缓慢甚至死亡。盖草能是一种选择性杀灭有害草类的除草剂，能被叶片吸收并运输至整个植株，安全性高，已被广泛应用于油菜、棉花等作物除草工作中［13-15］，但在胡麻中相关研究较少。基于此本研究对盖草能在胡麻田中的安全应用及其靶标基因的表达模式进行了相关研究。

盖草能属于ACCase抑制剂类除草剂，胡麻具有异质型ACCase，对其有一定的抗性。盖草能靶标基因AccA的表达量可以反映植株对盖草能的敏感度。本研究发现盖草能胁迫处理下，AccA基因在胡麻叶片中的表达量随时间变化呈现出先增后减的趋势。同时还发现，适量施用盖草能对胡麻植株没有明显的药害影响，植株会恢复正常生长；过量喷施会抑制胡麻生长发育，对胡麻的生长有明显的药害，表现为叶色失绿，叶片萎蔫，茎叶出现不同程度药害斑等，植株矮小，而且难以恢复正常生长，这与前人研究结果一致［12］。另外，对处理植株进行枯萎率及相关分析发现，药剂浓度越高，植株枯萎率越高，二者之间呈显著正相关（p＜0.05），处理时间与株高呈极显著正相关（p＜0.01）。

本研究旨在研究不同浓度盖草能处理下胡麻植株的生长状况及其靶标基因AccA的表达模式，结合相关性分析，为胡麻种植中科学合理使用盖草能提供理论依据，从而为进一步培育抗盖草能胡麻种质资源奠定基础。

4 结论

胡麻幼苗经盖草能处理后，随着时间的变化植株出现了不同程度的药害现象，且喷施盖草能浓度越大药害越严重，植株较矮小，喷施10 mL/L盖草能对胡麻植株相对安全，植株可以恢复正常生长，与对照植株无明显差异；AccA基因作为盖草能靶标基因，其表达量随时间变化呈现先增后减的趋势，且在施药24 h后达到最高；药剂浓度与植株枯萎率呈显著正相关（p＜0.05），处理时间与株高呈极显著正相关（p＜0.01）。