针刺干预对单眼视觉剥夺模型大鼠视皮层方位柱“漂移”和异常重组的调节作用及其脑功能机制

叶钰娟, 张娟娟, 马重兵, 严兴科

（甘肃中医药大学针灸推拿学院，甘肃 兰州 730000）

弱视是指在视觉发育期内因各种病因引起的单眼或双眼最佳矫正视力低于相应年龄的视力，眼部检查常无器质性病变或弱视眼视力低于健侧眼视力2 行及以上，视力较低眼称为弱视［1］。全球弱视患病率约为4%［2］；中国儿童弱视的患病率为1%～2%，以人群为基础的研究［3］显示弱视的患病率为1%～5%。弱视常分为斜视性、屈光参差性、先天性、形觉剥夺性和屈光不正性等，其中单眼形觉剥夺性弱视较双眼弱视后果更为严重，因其疾病转归预后不佳，严重影响患者身心健康发育［1］。近年来，越来越多的研究［4-5］从脑功能成像角度探索弱视引起的大脑皮层结构及脑功能损伤，主要以功能磁共振成像（尤其是静息态功能磁共振成像）技术为主，然而上述技术主要偏重于相关脑区或脑区之间功能（网络）连接为主，对大脑皮层功能改变的研究较少。针灸疗法在弱视治疗中具有操作简单、疗程短、不良反应较少和明显改善视力及视功能等优点，目前在眼科临床中应用日益增多［6-7］。本研究采用功能近红外光谱技术（functionality near infrared spectroscopy，fNIRs），基于神经血管耦合机制，从血氧响应角度观察单眼剥夺大鼠不同方位刺 激 下 视 皮 层 方 位 柱 氧 合 血 红 蛋 白（oxyhemoglobin， Oxy-Hb）、 脱 氧 血 红 蛋 白（deoxygenated hemoglobin，Deoxy-Hb） 和 总 血 红蛋白（total hemoglobin，Total-Hb） 浓度的变化，检测评估视皮层方位柱对单眼剥夺损害的响应模式，探讨针刺干预对视皮层方位柱异常功能改变的调节作用，为针灸干预形觉剥夺效应的脑功能机制和应用研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器70 只SPF 级健康14 d 龄SD 大鼠，体质量（30±5）g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，质量合格证编号：62000600000513，动物生产许可证号：SCXK（甘）2015-0001。水合氯醛（天津市大茂化学试剂厂），左 旋 多 巴 甲 酯 （levodopa methyl ester hydrochloride，LDME）（上海阿拉丁生化科技公司）。罗兰传统多焦视觉电生理诊断仪（德国ROLAND CONSULT Stasche & Finger GmbH 公司），fNIRs 采集与分析系统（美国NIRX 公司）。

1.2 实验动物模型制备和分组70 只大鼠适应性饲养后，随机分为空白对照组10 只和造模组60 只。空白对照组常规饲养，造模组60 只大鼠模型复制3 d 后，选择右眼闭合良好、不漏光大鼠50 只，随机分为模型组，LDME 组，早期、中期和末期针刺组，每组10 只。本实验过程中对动物的处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。依据文献［8］方法复制右眼剥夺大鼠模型：大鼠按0.3 mL·100 g－1体质量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪除眼睑缘周围毛发，严格消毒大鼠右眼眼睑后，自内眦到外眦剪除上下睑缘各1.0～1.5 mm，皮下及皮肤分层缝合，封闭实验眼。以大鼠出现图形视觉诱发电位（pattern visual evoked potential，P-VEP）潜伏期延长和振幅降低为模型复制成功的标准。

1.3 干预方法LDME 组按照体质量给予LDME 40 mg·kg－1灌胃，从模型复制后第3 天开始，连续治疗30 d。穴位定位参照《实验针灸学》［9］及《大鼠断层解剖彩色图谱》［10］进行定位。睛明：眼内角、上下眼睑间；攒竹：当眉头凹陷中，眶上切迹处；风池：项部，当两耳后角连线中点与耳后角外1/3 和内2/3 处；光明：在小腿外侧下1/3，趾长伸肌和腓骨短肌之间。

早期针刺组大鼠在模型复制后第3 天开始针刺治疗，中期针刺组大鼠在模型复制后第12 天开始针刺治疗，末期针刺组大鼠在模型复制后第21 天开始针刺治疗［11］。取双侧睛明、攒竹和风池斜刺5 mm，双侧光明直刺3 mm。以Φ=0.25 mm、长度为15 mm 的毫针（苏州医疗用品厂有限公司）进行治疗，进针后行捻转平补平泻法。每日1 次，每次留针10 min，每组治疗期均为9 d。

1.4 各组大鼠P-VEP 检测P-VEP P100波潜伏期和振幅检测：数据采集前进行麻醉处理，大鼠按体质量给予4%水合氯醛0.3 mL·100 g－1腹腔注射麻醉。检测时将大鼠固定，调整双眼视轴，使其角膜映光点与视屏中心标记点平行。检测电极内置电极膏，连接13 mm 毫针，参考电极于大鼠内眼角连线中点刺入，记录电极于大鼠枕骨粗隆上0.5 cm刺入，地电极于大鼠面颊部刺入，刺激时大鼠受试眼角膜与视刺激视屏垂直距离为50 cm。模式反转刺激器设置：刺激频率4.00，图形大小10×10，满视野；模式图案：棋盘格。放大器设置：上限频率500 Hz；下限频率1 Hz；记录电极为OZ；参考电极为Fpz；采样时程300 ms。记录电极与参考电极间阻抗≤2 kΩ。

1.5 各组大鼠视皮层中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 浓度检测每只大鼠在不同方位刺激状态下采集180 s，应用美国NIRStar13-0 软件进行数据采集。fNIRs 主要检测指标包含Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 浓度，采用Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 浓度绝对值在大鼠模型中构建相应大脑皮层血流示意图。大鼠视冲动传导终止于视皮层区（17 区）。以320 g 大鼠为标准计算各大鼠的视皮层17 区范围（中线旁开1.80～3.23 mm，距前囟4.31～5.75 mm）。参考《大鼠脑立体定位图谱》［12］和分析软件matlab 平面图对照，确定相关脑区。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠P-VEP P100波潜伏期和振幅以±s表示，各组大鼠左和右侧眼比较采用配对样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验或LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。fNIRs 采用R 软件（i3863.6.1）调用数据包完成主成分分析和偏最小二乘法聚类分析法。

2 结果

2.1 各组大鼠视觉电生理P-VEP P100波潜伏期和振幅与空白对照组左眼比较，空白对照组大鼠右眼和其余各组大鼠左眼P100波潜伏期及振幅差异均无统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组右眼比较，模型组大鼠右眼P100波潜伏期明显延长（P＜0.05），振幅明显降低（P＜0.05）；与模型组右眼比较，LDME 组和早期针刺组大鼠右眼潜伏期均有不同程度缩短（P＜0.05），LDME 组和早期、中期及晚期针刺组大鼠振幅均有不同程度升高（P＜0.05）；与LDME 组右眼比较，中期和末期针刺组大鼠右眼P100波潜伏期明显延长（P＜0.05），振幅明显降低（P＜0.05）；与早期针刺组比较，中期和末期针刺组大鼠右眼P100波潜伏期明显延长（P＜0.05）， 振 幅 明 显 降 低（P＜0.05）。见 表1 和2。

表1 各组大鼠P100波潜伏期Tab.1 P100 wave latencies of rats in various groups(n=10，x±s，t/ms）

表2 各组大鼠P100波振幅Tab.2 P100 wave amplitudes of rats in various groups(n=10，x±s，μV）

2.2 各组大鼠不同方位刺激下左和右侧视皮层中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 及Total-Hb 浓度经主成分分析和偏最小二乘法聚类分析法分析，不同方位刺激状态下，各组大鼠右侧视皮层中Total-Hb 浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组左侧视皮层比较，模型组大鼠视皮层中Oxy-Hb 和Total-Hb 浓度明显降低（P＜0.05），Deoxy-Hb 浓度明显升高（P＜0.05），各针刺组Oxy-Hb 和Total-Hb 浓度明显升高（P＜0.05），Deoxy-Hb 浓度明显降低（P＜0.05）；各组大鼠右侧视皮层中Oxy-Hb 和Deoxy-Hb 浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）， LDME 组 左 侧 视 皮 层Oxy-Hb 和Deoxy-Hb 浓度优于早期针刺组（P＜0.05），早期针刺组大鼠视皮层中Oxy-Hb 和Deoxy-Hb 浓度优于中和末期针刺组（P＜0.05），中期与末期组左侧视皮层上述3 种浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1和2。

图1 各组大鼠2-5 通道不同方位刺激下右侧视皮层中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 浓度Fig. 1 Concentrations of Oxy-Hb, Deoxy-Hb, and Total-Hb in right visual cortex of rats in various groups under 2-5 channel stimulation in different directions

2.3 各组大鼠不同方位刺激状态下Oxy-Hb 浓度血流图各组大鼠左右侧Oxy-Hb 浓度比较，空白对照组大鼠左右侧Oxy-Hb 浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组和LDME 组大鼠右侧Oxy-Hb 浓度均高于左侧（P＜0.05）；早期针刺组大鼠左右侧Oxy-Hb 浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）；中期和末期针刺组大鼠右侧Oxy-Hb浓度高于左侧（P＜0.05），表明早期针刺能有效调节大鼠视觉剥夺后视皮层方位柱“漂移”和重组现象。见图3。

图3 各组大鼠不同方位刺激下大脑皮层血流示意图Fig.3 Schematic diagram of cerebral cortical blood flow of rats in various groups under stimulation in different directions

选取各组大鼠不同方位刺激状态下第160 秒时，以Oxy-Hb 为标准，从顶到底大脑皮层血流平面示意图。每幅图的第1 列和第2 列分别代表该组的右侧和左侧视皮层血氧浓度，大脑皮层血氧浓度的变化以底部图尺的特定颜色判定：越趋近深红色，Oxy-Hb 浓度越高，表明该处大脑皮层活动相对活跃；越趋近深蓝色，Oxy-Hb 浓度越低，表明该处大脑皮层活动受到一定程度的抑制。

3 讨论

HUBEL 等［13］和WIESEL 等［14］系统地研究了视皮层细胞的功能组织，发现具有相同最优方位的皮层细胞以一种非常规则的方式，在从皮层表面到下边的白质之间2 mm 的灰质内排列成柱状，称作方位功能柱。根据不同亚层的区别，方位柱内也有不同的来源，而不同位置的方位也将有不同的用处。初级视皮层上许多细胞对处于一个特殊方位的亮的边界和线段有最优的刺激，这种优势方位在皮层的深度方向上，也就是与皮层表面垂直的方向上，仍然大致相同，但在沿皮层表面的方向上方位大部分平缓地变化。利用光学成像方法能够形象地观察到不同优势方位的分布情况，这种由垂直于皮层表面排列的，连成薄片状的薄层方位细胞做成的薄板结构，称为方位柱［15-16］。

弱视不仅能导致视力低下，还常常伴有包括立体观、对比敏感度、形状知觉、轮廓整合和运动处理等其他视功能障碍。弱视视觉系统有着明显的空间不确定性，当刺激特征靠得很近时，弱视患者不能准确地判断相对位置、宽度和朝向，而正常人却能良好完成，而对于屈光参差性弱视来说，空间信息的丢失与其下降的分辨率和对比敏感度是相当的［17］。右眼视觉剥夺后，左侧视皮质神经元代谢活动减弱，对视觉输入方位信息的加工和感受功能出现抑制和损害，右侧视皮质方位柱功能明显增强［18］，相对出现视皮层功能柱从左侧向右侧“漂移”的现象，即为视功能柱功能和结构发生可塑性重组改变。

fNIRs 技术通过检测血红蛋白浓度，可以实时、动态地反映测量点局部血氧代谢和脑区神经元活动，为大脑皮层功能活动与脑组织解剖位置对应关系的建立和评估提供技术支持［19］。用于检测单眼剥夺导致视皮层功能柱“漂移”，对弱视的早期诊断、临床疗效判定和发病机制研究具有重要意义［20］。P-VEP 中P100波具有稳定性和重复性较好的优势，可以反应视觉通路、视觉传导能力及视皮质的功能，成为临床检测和评价视功能的主要指标［21］。

本课题组经过长期临床总结，并在针刺治疗弱视安全有效的基础上，提出“调气通经明目”针法［22-23］，选取睛明、攒竹、风池和光明四穴为主穴，睛明和攒竹穴为近部取穴，能疏通眼周之经脉，濡养局部之气血，风池和光明穴为远部取穴，联络肝经，疏通肝胆气血、疏通阳维脉气血，使经脉畅通，气血上达于目而能视。四穴相配，远近结合，达到“调理气机、疏经通络、明目增视”的目的。同时，研究［24-27］表明：风池穴可以调节视觉中枢及邻近脑区功能活动，调制默认网络脑功能连接，而针刺光明穴产生的神经冲动由躯体感觉纤维传入中枢，能够影响大脑相应脑区的活动程度及血氧水平，其中视皮层区域反应更加明显。LDME是目前临床治疗弱视的常用药物，具有一定权威性［28］。研究［29］表明：弱视眼视皮层中枢对图形运动感觉及边界对比效应敏感的神经元功能存在异常，因此所有类型的弱视均有P-VEP 潜伏期延长和振幅降低的表现。本研究造模成功后，在敏感期内针刺治疗后，P100波振幅升高，潜伏期提前，针刺可有效增强视觉通路生物电活动，从而拮抗弱视对视觉系统的损害，且早期针刺更有效；同时fNIRs 指标中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 浓度检测结果显示：右眼视觉剥夺后，左侧视皮质神经元方位信息感知的敏感性和选择性明显抑制，右侧视皮质以上功能相对增强，LDME 和早期针刺均能不同程度地改善和保护视皮层方位柱功能的损害，也证实“调气通经明目”针法能有效逆转视觉剥夺后视觉加工和感受功能损害，抑制“眼优势”现象，并能够有效调节和恢复视觉剥夺导致的双侧视皮层功能柱发育不平衡，对视功能柱可塑性“漂移”改变有明显的干预和调节作用，而且早期治疗是取得疗效的关键。

图2 各组大鼠4-4 通道不同方位刺激下左侧视皮层中Oxy-Hb、Deoxy-Hb 和Total-Hb 浓度Fig. 2 Concentrations of Oxy-Hb,Deoxy-Hb and Total-Hb in left visual cortex of rats in various groups under 4-4 channel stimulation in different directions

综上所述，本研究从单眼剥夺大鼠视觉电生理通路和视皮层方位柱功能改变角度探讨了单眼剥夺后视觉皮层功能改变，但未研究具体方位柱形态学改变，有待进一步研究与分析。