血管内皮生长因子在牙周组织再生中作用的研究进展

田 悦, 陈慧珊, 张佩佩, 申玉芹

（吉林大学口腔医院牙周科，吉林 长春 130021）

牙周炎是一种由细菌感染引起的牙周组织慢性非特异性炎症疾病，是导致成年人失牙的主要原因。当感染和炎症突破牙龈上皮组织和结缔组织，蔓延至深部的牙周组织时，会引起牙龈和牙周膜胶原纤维溶解破坏以及牙槽骨吸收，导致牙周袋的形成。感染和炎症若不受控制继续发展则会使牙周袋进一步加深，甚至达到牙根根尖处，最终造成牙齿的松动和脱落。针对牙周炎的治疗主要围绕菌斑清除、感染控制以及疗效的维护进行，如洁治、刮治、根面平整（scaling and root planning， SRP）和局部药物的应用，临床目标是停止牙周组织的破坏和长期保存牙齿，而使受损的牙槽骨等牙周组织进行生理性和功能性的再生是牙周修复治疗的关键。

血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 作为一种促进血管生成的细胞因子，参与包括牙周炎在内的许多血管生成依赖性疾病的发生发展［1-2］。一方面，牙周炎症的进展过程中往往伴随着新生血管的形成，炎症组织可以使各种炎性因子表达升高，调节新生血管的形成，而新生血管形成的同时又能使炎性细胞与因子可直接到达炎症部位加重炎症程度，并为炎症的肉芽组织提供氧气和营养物质，使炎症反应长期存在。新生血管又使内皮表面积增加，为细胞因子、黏附分子以及其他促炎因子产物提供更大的底物潜能。另一方面。VEGF 与牙周病炎症的消退和修复具有相关性，其通过细胞募集使得牙周相关细胞借由新生血管到达损伤部位，并联合其他细胞因子和生长因子发挥协同作用，促进牙周组织再生。目前VEGF 的研究因其在血管生成过程中的重要意义，集中在癌症或其他疾病的病理过程中，在牙周炎中的作用研究多呈现在牙周炎经治疗后的VEGF 表达水平的变化。国内有VEGF 在牙周组织中的表达与作用的相关报道，但并未有VEGF 促进牙周组织再生作用的描述，现针对VEGF 在牙周组织再生过程中的作用、作用机制及其在牙周组织再生中的应用进行探讨，旨在为VEGF 用于调控牙周组织再生奠定基础。

1 VEGF 的生物学特性

VEGF 是一种有效的促血管生成因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。VEGF 基因位于人类6p21.3 染色体上，全长14000 bp，是VEGF /血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor， PDGF）基因家族中的一部分，也称为胱氨酸结生长因子超家族。VEGF 是一种相对分子质量为40000 的异二聚体糖蛋白，其蛋白质结构中某些双硫键居于不同位置，其中包含胱氨酸结基序。

人类VEGF 家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F 和胎盘生长因子（placental growth factor， PLGF） 以及近期新发现的内分泌腺衍生的血管内皮生长因子（endocrine gland-VEGF， EG-VEGF） 等多个成员［3］，不同成员在体内执行不同的功能。

与VEGF 进行特异性结合的具有高亲和力的酪氨酸激酶受体称为血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR），主要分为3 类：VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1 和VEGFR-2 主要分布于肿瘤血管内皮表面， 调节肿瘤血管的生成；VEGFR-3 主要分布于淋巴内皮表面，与淋巴管密度有关，调节肿瘤淋巴管的形成。VEGF 与VEGFR 的结合受到新血管发生的调节。VEGF 与VEGFR 结合后，受体自身磷酸化，从而激活了多种细胞内信号通路，诱导血管内皮细胞增生，促进新生血管形成。

2 VEGF 的成血管-成骨耦合作用

VEGF 在促进新生血管形成过程中扮演着重要角色，同时也与骨的形成和再生过程密不可分［4］。一方面，VEGF 自身作用于成骨细胞上，促进成骨细胞的趋化、增生与分化；另一方面，VEGF 能调节人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells， hMSCs） 或 内 皮 祖 细 胞 （endothelial progenitor cells， EPCs） 向 成 骨 细 胞 的 分 化。VEGF 将成血管作用和成骨作用紧密串联起来，使新生血管的形成参与到骨形成过程中，血管中的血液为骨组织输送氧气和营养物质，转运代谢产物，起到了营养作用。在骨骼受创或骨折发生后，骨组织会处在炎症所造成的缺氧环境中，其恢复需依赖血管生成和骨生成的耦合［5-6］，通过膜内成骨或软骨内成骨的方式愈合。VEGF 在这种耦联过程中起重要作用：在受伤的骨组织附近，大量的血管迅速形成并通过血液转运来各种不同的细胞因子参与炎症反应，VEGF 在其中高水平表达，促进周围血管向骨缺损区域侵入并新生血管，对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells， BMSCs） 行趋化作用，使干细胞增生分化为成骨细胞，然后分泌类骨质，钙化形成骨基质，最后形成骨化中心，在这过程中，成骨细胞又能分泌VEGF 等因子反作用于血管的调节。

3 VEGF 在牙周组织再生中的作用及其机制

VEGF 通过调节参与牙周组织再生的细胞增殖、迁移和分化等功能，在炎症发生及骨损伤部位促进血管的新生，整合新生的牙周组织，促进牙周组织的修复再生。

3.1 VEGF 促进牙周组织再生的细胞增殖和迁移VEGF 可以促 进hMSCs、 牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）和成骨细胞的增殖及迁移能力［7-8］，以提升牙周组织再生效果。 VEGF-C 依赖于细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK） 通路和局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）通路促进hMSCs 迁移。而hMSCs 自身释放的VEGF 可以触发牙槽骨成骨细胞的趋化性。LEE 等［9］研究显示：VEGF 对PDLSCs 和BMSCs的增殖均无显著影响。但另一项研究［10］显示：VEGF 可以呈时间依赖性地促进PDLSCs 增殖，在划痕损伤愈合实验中可促进细胞向创伤部位迁移，VEGF 还可显著促进细胞黏附。

3.2 VEGF 促进牙周组织再生的细胞成骨分化VEGF 可以促进hMSCs 和PDLSCs 的成骨分化作用，从而增强牙周组织再生能力。VEGF-C 通过VEGFR-2 和VEGFR-3 介导，能诱导hMSCs 成骨分化，并激活ERK/Runt 相关转录因子2（Runtrelated transcription factor 2， RUNX2）信号通路［11］。BMSCs 和EPCs 共培养在含VEGF的复合支架中，应用于犬的下颌骨缺损［12］，VEGF 的持续递送使层状骨形成趋势变大，可发生显著的成骨作用。在小鼠皮下模型中植入含有BMSCs 的共聚物支架后，VEGF-A 的递送可增强血管生成作用，但不足以促进成骨［13］。而LEE 等［9］对体外培养及植入小鼠皮下的PDLSCs 和BMSCs 进行观察发现：碱 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase， ALP） 和Runx2 基因表达水平升高，VEGF 可促进PDLSCs和BMSCs 的成骨分化，并具有微弱的累加作用。在启动成骨分化的过程中，VEGF 通常激活SMAD、 p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）和磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K） /蛋白激 酶 B （protein kinase B， PKB/Akt） 等通路［14-19］。此外，VEGF还可通过YAP/TAZ 途径，借由F-肌动蛋白促进转录共激活因子相关蛋白YAP的核定位［20］，从而促进BMSC 的 成 骨 作 用。

3.3 VEGF 促进骨缺损区域新生血管的形成VEGF 通过增强内源性内皮细胞和干细胞的迁移，使更多的血管在骨缺损部位形成［21］。由腺病毒单独介导VEGF-A 基因表达的BMSCs 被接种于支架上植入小鼠皮下，可以增加局部的毛细血管样或血管样结构。犬下颌骨缺损中应用的BMSCs 和EPCs 共 培 养 支 架［12］，VEGF 的 加 入 使 得 缺 损 部 位毛细血管密度显著增加。

3.4 VEGF 促进牙周组织的重建VEGF 可促进包括牙槽骨、牙周膜和牙骨质的牙周组织重建。抗VEGF 抗体贝伐单抗在小鼠牙槽骨形成过程中对血管形成抑制作用，研究［22］显示：VEGF 被抗体中和后，骨膜蛋白的定位和表达水平改变，影响牙槽骨的形态发生，抑制血管、牙周膜和骨形成，从而使牙槽骨组织的整合遭到破坏。

4 牙周组织再生过程中VEGF 的表达水平

由于VEGF 对牙周组织再生相关细胞具有增殖和趋化等作用，且本身的促血管生成功能对炎症疾病的发展有明显影响，因此VEGF 的表达水平常被纳入到对牙周炎治疗效果的观察中。

在牙周基础治疗及手术治疗以促进牙周组织的修复再生研究中发现VEGF 水平可发生变化，如在对牙周基础治疗后患者血清和龈沟液中VEGF-A水平的研究［23］显示：慢性牙周炎患者血清和龈沟液中VEGF-A 水平明显高于健康对照个体，在接受包括口腔卫生指导以及SRP 等非手术治疗6 周后，VEGF-A 水平明显降低，但探诊深度（probing depth，PD）、临床附着水平（clinical attachment level，CAL）和牙龈指数（gingival index，GI）等临床指标均有所改善。对病情更严重的广泛性侵袭性牙周炎患者进行4 周的定期洁治和SRP 后［24］，患者的临床指标均有所改善，但患者龈沟液中VEGF 水平明显高于健康对照组，与未治疗时的龈沟液中VEGF 水平保持相对一致。而使用微创皮瓣反射（minimally invasive flap reflection， MIS）治疗牙周组织缺损时，龈沟液中可内源性释放VEGF，与传统的开放式皮瓣清创术（open flap debridement，OFD） 疗效比较发现：在愈合的早期阶段，MIS 治疗组VEGF 水平明显高于OFD 治疗组，经MIS 治疗后9 个月患者PD 减少和CAL 明显增加［25］。

自体皮质骨移植物（autogenous cortical bone graft，ACB） 与Ankaferd 止血剂（Ankaferd blood stopper，ABS）联合应用治疗骨内牙周缺损，缺损部位龈沟液中VEGF 水平明显高于单纯植骨组，血管生成和血管内皮细胞功能得到增强，ABS 的应用进一步加强了ACB 填充骨缺损的效果，促进了软组织愈合，防止牙龈退缩，CAL 明显升高［26］。将载有苯妥英钠或硝苯地平的聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］微球用于大鼠上颌第一磨牙近中的牙周组织缺损处并压实，以确保微球保持静止并能重新分布，与伤口区域的牙周膜细胞立即接触，结果显示：VEGF-A 蛋白表达明显升高，天狼星红染色的Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ） 呈强阳性，骨钙蛋白（osteocalcin，OCN） 阳性表达增强，产生了广泛的骨再生［27］。在大鼠双侧上颌第一磨牙近中处手术制造三壁骨缺损后应用釉质基质衍生物（enamel matrix derivative， EMD），VEGF 水平明显升高，且当EMD 应用在牙周病模型的糖尿病大鼠中，VEGF 水平也明显升高［19］，术后7 d 时软组织伤口愈合良好，28 d 时可见狭窄的近中缺损处充满了新形成的结缔组织、牙骨质和骨组织。EMD能促进大鼠口腔黏膜手术伤口的愈合，处理过的部位显示出血管密度升高，且VEGF mRNA 表达水平升高［19，28］。紫草素能促进人牙龈成纤维细胞增殖、迁移和细胞中VEGF mRNA 表达水平，1 μmol·L－1紫草素是刺激细胞增殖和迁移的最佳浓度，在该浓度紫草素作用下能明显增加VEGF 的表达水平，诱导Col Ⅰ和纤连蛋白（fibronectin，FN）的产生，通过增强血管生成和牙龈结缔组织的黏附促进伤口愈合［29］。阿司匹林增强PDLSCs成骨潜能的同时，VEGF-A 与VEGF-C mRNA 表达水平明显升高［30］。骨膜素能促进PDLSCs 的增殖，增强成骨功能，VEGF 表达水平也随之升高［31］。

光生物调节（photobiomodulation，PBM） 等非侵入性治疗手段，在应用于牙周治疗时能加速伤口愈合过程，提升VEGF mRNA 表达水平［32-33］。在评价近红外低强度激光对PDLSCs 增殖、生存和成骨分化能力影响的实验中，GHOLAMI 等［32］发现：PDLSCs 的增殖率未受影响，成骨分化能力得到提升，可在光学显微镜下观察到矿物质沉积和矿化结节，且VEGF 具有较高的mRNA 表达水平。经炎症细胞因子激发的牙龈成纤维细胞接受低水平激光治疗（low-level laser therapy，LLLT）后，被抑制的牙龈成纤维细胞的迁移能力得到改善，细胞中VEGF mRNA 表达水平升高。

5 VEGF 在牙周组织再生中的应用

5.1 VEGF 与牙周支架的联合应用目前，寻找有效的牙周再生支架材料是一个具有重要意义的研究方向。近年来，有关VEGF 和血管生成与支架材料促成牙周愈合的研究受到广泛关注。一种应用于骨缺损愈合的薄层PLGA 涂层的β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate， β -TCP） 支 架， 能 使VEGF 包含其中并持续释放，其在体外骨骼再生中显示出良好的效果［34］。自组装肽（self-assembling peptide， SAP） 纳米纤维水凝胶被用作支架材料应用于手术产生的大鼠双侧第二磨牙的牙周缺损，SAP 水凝胶通过促进细胞募集和血管生成促进牙周组织缺损的愈合，VEGF 表达水平升高，在72 h内PDLSCs 增殖随时间呈线性增加，术后4 周时可观察到牙周膜样胶原束和新的牙骨质状结构薄层形成，类似于天然的牙周膜，较整齐地排列并倾斜插入牙根表面，并且骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的表达水平明显升高，成骨细胞增殖分化，新骨形成［35］。MATSUGAMI 等［36］在 剥 离 了 大 鼠 上 颌 第一磨牙近中根的牙周膜、牙骨质和浅层牙本质后，将与短肽RADA16 结合的SAP 填充在缺损处，术后2 周通过Micro CT 法观察，大鼠上颌骨缺损区域填充SAP 组较未填充SAP 组愈合效果更好，骨体积增高，骨小梁加厚，HE 染色结果显示：填充SAP 的骨缺损区域有较好的愈合效果，先前的缺损区域内充满了结缔组织，靠近根端缺损部位有新骨形成，免疫组织化学染色发现新生结缔组织内血管与骨组织周围有大量VEGF 阳性细胞。

5.2 调节VEGF 的相关信号分子和通路促进牙周组织再生VEGF 能通过血管生成和细胞募集参与牙周组织的发育和重塑，因此调节有关VEGF 的信号分子可以促进牙周组织再生。与无支架材料条件下培养PDLSCs 的比较，mRNA-210 介导的三维羟基磷灰石陶瓷支架上培养的人PDLSCs 中VEGF释放增加，成骨分化更为明显，细胞外沉积明显增加，骨生成相关标志物RUNX-2、ALP 和OPN 均上调［37］；通过刺激与miR-210 表达相关的细胞分泌VEGF 的能力，人PDLSCs 的黏附能力和增殖能力得到增强。采用CXCL12 基因转导入PDLSCs，CXCL12 的过表达显著刺激了VEGF mRNA 和蛋白表达水平，其还与VEGF 产生协同作用，增强PDLSCs 的血管生成潜力，使PDLSCs 形成更长的毛细管样结构。在临界颅骨缺损的大鼠模型中，CXCL12 能促进PDLSCs 的骨组织修复能力，Micro-CT 法检查结果显示：缺陷部位可见大量的板层状骨质结构形成，从冠状面和矢状面能观察到新骨膨胀并几乎占据了整个骨缺损区域［38］。长链非编码RNA FER1L4 的过表达能促进PDLSCs 的成骨分化，增加VEGF-A 表达，在裸鼠颅骨缺损实验中，将具有FER1L4 过表达的PDLSCs 加载到PLGA 支架上植入缺损区域，缺损区域周围形成新的胶原组织和骨组织， 与无FER1L4 组比较，FER1L4 过表达组新胶原纤维和骨组织的形成数量增 多， OCN 阳 性 表 达 的 范 围 和 强 度 更 高［39］。FER1L4 的抑制剂则抑制上述过程：miR-874-3p 作为FER1L4 的抑制剂，直接靶向抑制STAT3 途径，下调VEGF-A 表达，阻碍成骨作用。而FER1L4可以通过吸收miR-874-3p 参与PDLSCs 的成骨作用且上调VEGF-A 的表达，靶向调节VEGF-A 促进hPDLSCs 的成骨分化。对连接蛋白43 半通道（connexin 43 hemichannels， Cx43 HC） 的阻断能上调VEGF-A 的表达［40］，在此过程中ATP 信号传导被阻断，ERK 1/2 信号通路被激活，最终促进牙龈伤口的愈合。EMD 通过PI3K/Akt/VEGF 途径的调节使大鼠牙周缺损组织部位VEGF 表达水平升高［19］。紫草素通过ERK1/2 信号通路对人牙龈成纤维细胞产生影响，促进VEGF、ColⅠ和FN 的表达，对人牙龈成纤维细胞参与的伤口愈合产生增益效果［29］。抗菌肽LL37增加人PDLSCs中ERK1/2和核转录因子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）p65 的磷酸化水平，诱导细胞中VEGF-A 的产生，促进血管生成的同时促进牙周组织再生［41］。

5.3 VEGF 与其他细胞因子的联合应用在牙周炎症消退和治愈的过程中，VEGF 不仅促进血管新生，还与通过血管聚集的各种细胞因子发生相互作用，协同促进牙周组织再生。转化生长因子β（transforming growth factor-β， TGF-β） 是调节细胞生长和分化的多功能细胞因子，研究者利用过表达的特异性蛋白1（specificity protein 1， SP1） 增加TGF-β1 的表达水平，激活SMAD2 信号通路并加强了VEGF 的分泌，从而促进成骨细胞的血管生成［42］。骨形态发生蛋白2 （bone morphogenetic protein 2， BMP2）可以促进间充质细胞定向分化为成骨细胞，当BMP2 和VEGF 同时作用于前成骨细胞时，激活p38 MAPK 途径，增加osterix 蛋白的核易位，增强骨诱导作用，进一步促进成骨细胞的分化与成熟［15］。牙周袋局限的空间容易形成缺氧环境，缺氧诱导因子1α （hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α） 由 丝 裂 原 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶（mitogen extracellular signal regulated kinases，MEK）/ERK 和p38 MAPK 途径调控产生产生后，诱 导VEGF 参 与PDLSCs 成 骨 表 达 的 提 升［16-18］。在2% O2存在的低氧条件下，PDLSCs 的细胞活力、ALP 表达活性和VEGF 释放水平均随时间延长明显升高，Runx2 和Sp7 mRNA 及蛋白表达水平较对照组明显升高，且PDLSCs 的钙化结节形成增加，在第5 天达到密度峰值。同时，缺氧介导前列腺素E2（prostaglandin E2， PGE2）和VEGF 的旁分泌作用能刺激PDLSCs 增殖及向成骨细胞分化。将胰岛素样生长因子1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1）和VEGF 联合应用于异种骨移植材料治疗Ⅱ类骨壁缺损，在材料植入6 个月后可观察到，与单纯应用VEGF 比较，IGF-1 和VEGF 的联合应用更能促进骨的再生，显著改善牙周袋深度，增加CAL，测量垂直缺陷深度时可发现骨充盈量明显改善，且未发生明显的牙龈退缩情况［43］。而KAWAI 等［44］在MSCs 的条件培养基（conditioned media from MSCs，MSC-CM）中收集得到不同浓度的生长因子，包括IGF-1、VEGF、TGF-β1 和肝 细 胞 生 长 因 子 （hepatocyte growth factor，HGF），通过对大鼠MSCs 和在MSC-CM 中培养的人脐静脉内皮细胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）进行伤口愈合和血管生成的评估，RT-PCR 法检测结果显示：成骨和血管生成相关基因的表达水平明显升高，并且在大鼠牙周缺损部位上植入含MSC-CM 的胶原蛋白海绵后观察缺损部位牙周组织的再生情况，发现术后2周残留骨中有少量骨再生，并且在新生骨质附近有细胞团积聚，MSC-CM 植入4 周后在缺损处可观察到新生的骨组织表现出牙槽嵴样结构，缺损处牙本质表面出现牙骨质样结构，在牙骨质和新生骨之间还可见牙周膜状结构。SAKAGUCHI 等［45］通过模仿MSC-CM 制作的细胞因子混合物（cytokine cocktail， CC） 包含IGF-1、VEGF-A 和TGF-β1，在体外实验中，CC 促进了犬骨髓来源的MSCs 和牙周膜细胞的迁移，并促进HUVECs 的血管形成，体内实验则将CC 用于犬的人造Ⅱ级根分叉病变部位，术后8 周，在缺损的全部区域均能观察到新骨和牙骨质的形成，免疫组织化学染色可见在牙周膜周围以及骨表面有血管性血友病因子（von Willebrand factor， vWF） 阳性细胞的管形成，显示出CC 对血管生成以及新骨和牙骨质形成的促进作用。

6 总结与展望

牙周炎作为一种慢性感染性疾病，血管反应是其重要的中心环节。新生血管发生为破损的牙周组织带来了修复和再生的机会［1，23］。VEGF 是重要的促血管生成因子，其在牙周组织再生过程中的表现受到关注。VEGF 对牙周炎有促进作用，但是足量的VEGF 可以激活血管内皮细胞，形成新生血管并增加血管通透性，趋化MSCs 向炎症区域聚集，促进PDLSCs 等牙周相关细胞增殖、迁移和分化，同时促进成骨分化等细胞因子以及矿化所需的营养也能通过血管交通汇聚而来，这些表现表明其对损伤牙周组织具有修复能力。VEGF 在牙周炎症组织中的水平上调现象可能使其成为评估牙周炎炎症活跃程度的一种辅助指标。通过内源性地调节VEGF的表达水平、外源性地单独给予VEGF，或与其他细胞因子联合使用，VEGF 有望在这些途径多方面地应用于牙周组织再生。