颅脑损伤患者血清miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B蛋白表达与病情严重程度的关系*

吴豪杰, 施振华, 姚赞芳, 熊金丹

浙江新安国际医院 1神经外科，3急诊科(浙江嘉兴 314000)；2杭州师范大学附属医院神经外科(浙江杭州 310015)

颅脑损伤是常见的神经外科重症之一，具有发病率、致残率和致死率高特点，严重威胁患者生命健康[1-2]。早期诊断和治疗对颅脑损伤患者预后改善尤为关键，不同病情程度颅脑损伤治疗和预后差异较大。既往多采用格拉斯哥昏迷评分评估颅脑损伤的严重程度，缺乏客观性、准确性均较高的早期评估指标[3]。研究报道显示，神经元特异性烯醇化酶(NSE)和中枢神经特异性蛋白(S100B)是中枢神经系统损伤重要标志物，可用于评价中枢神经系统损伤程度[4-5]。微小RNA(miRNA)是长度为19～25个核苷酸的一类非编码分子RNA，与多种疾病发生、发展密切相关，是近年来临床研究热点[6]。因此，本研究探讨颅脑损伤患者血清miRNA-124和miRNA-132与NSE和S100B蛋白表达与病情严重程度相关性，为诊断颅脑损伤及病情严重程度评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择浙江新安国际医院于2018年1月至2020年12月颅脑损伤患者112例作为观察组，其中男79例，女33例；年龄21～75岁，平均(56.89±8.73)岁；致伤原因：交通事故64例，高坠坠伤32例，重物砸伤16例；依据格拉斯哥昏迷评分(GCS)分为轻中度组78例与重度组34例。另选择浙江新安国际医院于同期健康体检者96例作为对照组，其中男62例，女34例；年龄20～72岁，平均(57.32±8.59)岁。各组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经浙江新安国际医院伦理委员会批准(批号：2017-第34)。

纳入标准：(1)经颅脑CT或MRI证实为颅脑损伤；(2)临床资料完整；(3)年龄≥18岁；(4)签署知情同意书。

排除标准：(1)创伤前存在颅脑病变者；(2)合并颅内感染、脊髓病变及脑缺血等疾病；(3)合并造血系统、自身免疫系统及恶性肿瘤者；(4)妊娠或哺乳期妇女；(5)严重精神疾病者。

1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：NSE试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，S100B试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，Trizol试剂(南京森贝伽生物科技有限公司)，反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，qRT-PCR试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，总RNA快速提取试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)。

主要仪器：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(德国Roche公司)，伯乐iMark酶标仪(美国Bio-rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清miRNA-124和miRNA-132表达 采集受试者6 mL外周静脉血，以10 cm离心半径、3 000 r/min离心转速，离心8 min，收集血清，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定血清miRNA-124和miRNA-132水平。采用Trizol试剂提取血清总RNA，取5 μL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳并检测总RNA的纯度和完整度。按照反转录试剂盒说明书要求将其逆转录为cDNA，以U6作为内参基因，检测miRNA-124和miRNA-132 mRNA表达水平。总反应体系20 μL：SYBER GREEN 6.8 μL、PCR forward primer 0.4 μL、DYE I 0.4 μL、PCR reverse primer 0.4 μL、cDNA 2.0 μL、RNase-free H2O 10 μL，混匀，置于实时荧光定量PCR仪扩增。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性15 s、60℃退火1 min，延伸1 min，共40个循环，每个样品设置3个复孔。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt法(Ct为循环值)计算miRNA-124和miRNA-132 mRNA相对表达量。

1.3.2 血清NSE和S100B水平测定 采集受试者6 mL外周静脉血，以10 cm离心半径、3 000 r/min离心转速，离心8 min，收集血清，采用酶联免疫吸附法测定血清NSE和S100B水平，严格依据试剂盒说明书测定。

1.4 观察指标 (1)观察各组血清miRNA-124和miRNA-132 mRNA表达；(2)观察各组血清NSE和S100B表达；(3)分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B对颅脑损伤预测价值；(4)分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B与病情严重程度相关性。

2 结果

2.1 各组血清miRNA-124和miRNA-132 mRNA表达比较 轻中度组和重度组血清miRNA-124 mRNA表达高于对照组，而血清miRNA-132 mRNA表达低于对照组(P<0.05)；重度组血清miRNA-124 mRNA表达高于轻中度组，而血清miRNA-132 mRNA表达低于轻中度组(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清miRNA-124和miRNA-132 mRNA表达比较

2.2 各组血清NSE和S100B水平比较 轻中度组和重度组血清NSE和S100B水平高于对照组(P<0.05)；重度组血清NSE和S100B水平高于轻中度组(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清NSE和S100B水平比较

2.3 miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B对颅脑损伤预测价值 经ROC曲线分析，miRNA-124对颅脑损伤诊断敏感度为75.44%，特异度为43.64%；miRNA-132对颅脑损伤诊断敏感度为67.86%，特异度为35.71%；NSE对颅脑损伤诊断敏感度为86.76%，特异度为65.91%；S100B对颅脑损伤诊断敏感度为79.22%，特异度为62.86%。见表3。

表3 分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B对颅脑损伤预测价值

图1 miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B对颅脑损伤预测价值

2.4 miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B与病情严重程度相关性 经Pearson相关性分析，miRNA-124、NSE和S100B与重度颅脑损伤呈线性正相关，而miRNA-132与重度颅脑损伤呈线性负相关(P<0.05)。见表4。

表4 分析miRNA-124、miRNA-132、NSE和S100B与病情严重程度相关性

3 讨论

颅脑损伤主要是由于脑组织原发或继发性损伤造成颅内高压，导致脑灌注、脑组织代谢的持续恶化，若不采取及时有效的治疗，则会导致患者预后不佳[7-10]。血清学作为简单和敏感的一种检测手段，对诊断颅脑损伤具有较高临床价值。

NSE属一种神经元和神经内分泌细胞的蛋白酶，当出现神经细胞损伤后，从而会使得损伤的神经元细胞内释放出呈游离状态的NSE，进入脑脊液中，再跨越血脑屏障进入外周血循环，而造成血液及脑脊液中NSE水平升高[11]。张丰等[12]研究发现，颅脑损伤患者入院72 h血清NSE持续增高，且与脑死亡诊断呈正相关，及对脑死亡具有更高的诊断价值。由此可见，NSE作为神经元细胞损害的一种标志物，其敏感度和特异度较高。本研究表明，轻中度组和重度组血清NSE水平高于对照组且重度组高于轻中度组，由此可见颅脑损伤患者血清NSE水平升高，且随着病情加重升高越明显，分析其原因可能是由于脑损伤后的颅内压增高、脑水肿导致脑内血循环受阻，血脑屏障和脑血流量减少的进一步破坏，继发脑损伤，而导致NSE活性升高，且随着患者病情加重NSE水平升高越明显。S100B主要存在于中枢神经系统的少突胶质细胞、星形胶质细胞及周围神经系统的Schwann细胞。当神经组织受损时，则会导致胶质细胞分泌大量S100B蛋白[13]。随着S100B蛋白水平升高，可增加一氧化氮合成酶的弧形，且促进一氧化氮分泌，从而造成细胞因子激活更多星形胶质细胞和小细胞，激活核转录因子分泌细胞因子而导致炎性反应[14]。通常S100B不能任意通过血脑屏障，而当发生脑部损伤时，则会导致血脑屏障被破坏，并且脑脊液内S100B蛋白穿过血脑屏障进入血液中，而导致血液中S100B水平升高。梁炯芳等[15]学者研究表明，纳入105例颅脑损伤患者，其中重度颅脑损伤、中度颅脑损伤和轻度颅脑损伤患者S100B蛋白水平高于健康体检者，且呈剂量依赖性，可反映急性颅脑损伤患者病情进展。本研究表明，轻中度组和重度组血清S100B水平高于对照组且重度组高于轻中度组，由此可见颅脑损伤患者血清S100B水平升高，且随着病情加重升高越明显。

miRNA可通过调控基因表达对细胞凋亡、分化及增殖等细胞行为发挥调控作用。某些miRNA在神经保护、中枢神经系统信号传导通路的调节及中枢神经系统发生、发展等过程中发挥重要作用。近年来研究发现，miRNA在外周血中与颅脑损伤发生、发展具有相关性[16]。miRNA-124过渡激活可能造成促炎因子的爆发性释放，过度活化免疫细胞，且miRNA-124作用于Treg细胞，从而参与免疫抑制。程永红等[17]的研究报道显示，中重度颅脑损伤并发脑梗死患者血清miRNA-124表达高于对照组，且病情越重升高表达越高。miRNA-132被证实能够靶向抑制乙酰胆碱酯酶的活性和表达，提高乙酰胆碱水平及其抗炎作用，在树突状细胞的起源、突出形成及脑组织发育中发挥重要作用[18]。本研究表明，轻中度组和重度组血清miRNA-124 mRNA表达高于对照组而血清miRNA-132 mRNA表达低于对照组，重度组血清miRNA-124 mRNA表达高于轻中度组而血清miRNA-132 mRNA表达低于轻中度组，由此可见颅脑损伤患者血清miRNA-124呈高表达而miRNA-132呈低表达，但其具体作用机制尚未完全阐明。

综上所述，颅脑损伤患者血清miRNA-124、NSE和S100B呈高表达，而miRNA-132呈低表达，且与患者病情严重程度密切相关，具有重要临床研究价值。本研究还存在一些局限之处，样本量小，观察指标少，还需后续增加样本量和观察指标做多中心、多样本深入研究，提供可靠临床参考依据。

利益相关声明：所有作者声明均无任何利益冲突。

作者贡献说明：研究设计为吴豪杰；研究实施为施振华；资料收集为姚赞芳；论文撰写为吴豪杰；论文修订为熊金丹；审校为施振华。