半夏泻心汤加减治疗多囊卵巢综合征及胰岛素抵抗“异病同治”的网络药理学分析及实验验证

贾凡 赵红玉 郑冬雪 刘新敏

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期女性常见的的生殖内分泌紊乱性疾病，因其病因尚未明确、病理机制复杂、临床表现具有异质性、远期并发症繁多，所以属妇科领域的一大难题[1]。PCOS患者的典型特征包括性激素水平异常、胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)、卵巢多囊样改变、慢性亚临床炎症等。

IR是指细胞对胰岛素的反应不充分，导致葡萄糖摄取和利用受损的一种病理状态[2]。在过去的30年内，IR的患病率显著增加[3]。IR是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的核心环节，也是其关键病理生理特征之一[4]，亦属PCOS的重要病理变化，更是高血压、糖脂异常、心脑血管病等多种慢性疾病的基础[5]。据调查，约50%～70%的PCOS患者合并IR[6]。在IR状态下，机体会代偿性地增加胰岛素的分泌以维持相对正常的血糖水平，升高的胰岛素会通过多种途径引起雄激素水平上升，亦可导致卵泡发育障碍和生殖功能异常；高水平的胰岛素还会影响脂肪的储存及胆固醇、脂蛋白等物质的正常代谢过程，进而诱发代谢性疾病[7]。因此，IR是PCOS患者发生生殖功能紊乱和代谢异常的关键环节，干预IR对于改善PCOS及预防糖脂代谢异常等远期并发症具有重要意义。

半夏泻心汤源自《伤寒论》，原文有言“满而不痛者，此为痞，柴胡不中与之，宜半夏泻心汤”“呕而肠鸣，心下痞者，半夏泻心汤主之”，该方有苦降辛开、消痞散结的功效，主治寒热错杂之痞证[8]。现代常用于治疗胃肠炎[9]、糖尿病[10]等证属胃强脾弱、寒热错杂者。实验证实该方具有降低T2DM大鼠血糖、改善血脂代谢的作用，同时可以改善IR水平[11]。课题组前期研究发现，PCOS-IR患者多表现为月经后错、肥胖、多食、易饥、食后脘痞、早饱、便溏等症状，辨证多属于脾虚胃热型[12]；使用半夏泻心汤加减治疗超重合并IR的PCOS患者，结果显示半夏泻心汤加减可显著降低PCOS IR患者餐后2小时胰岛素、胰岛素曲线下面积，同时提高患者的基础体温周期双相率及累计妊娠率[13]。提示半夏泻心汤加减具有恢复排卵和自主月经、增强胰岛素敏感性、改善糖代谢的作用，是治疗PCOS-IR的有效方剂。进一步研究发现，半夏泻心汤加减在改善脾虚胃热型PCOS-IR患者的生殖内分泌水平、提高妊娠率及胰岛素敏感性等方面存在时效关系[14]。然而，半夏泻心汤加减治疗PCOS合并IR的作用机制的研究较少。

网络药理学是一门新兴学科，它从生物信息网络的角度阐释疾病、药物作用的相关机制[15-16]，其基于整体角度分析中药复方作用机制的理念切合中医整体论的思想[17]。本研究使用网络药理学的研究方法，对半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR可能的分子生物学机制进行探讨并进行实验初步验证，试从“异病同治”角度探究该方治疗PCOS及IR的作用机制。

1 材料与方法

1.1 半夏泻心汤加减的相关靶点筛选

通过TCMSP平台[18]查找清半夏、黄芩、黄连、干姜、党参、甘草、大枣、仙灵脾、枸杞子等中药的化学组成成分，按照口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且类药性(drug likeness，DL)≥0.18设置药代动力学的属性值并进行活性成分初步筛选以获得上述药物的活性化合物及其作用蛋白的对应靶点。使用Uniprot蛋白质数据(https://www.uniprot.org)检索靶点信息，将化合物作用的蛋白质靶点转化成对应的基因名称。

1.2 PCOS及IR疾病靶点筛选

以“polycystic ovary syndrome”及“insulin resistance”为关键词，分别在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Disgenet数据库(https://www.disgenet.org/)、Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)检索PCOS及IR相关的基因信息，检索物种设定为“人类(Homo sapiens)”。其中GeneCards检索的基因按照相关性得分(Relevance score)进行中位值筛选以获取较相关的靶点。将各数据库检索获得的基因数据取并集，并筛除重复值，获得PCOS及IR的疾病相关靶点数据。

1.3 半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR的作用靶点预测

使用Venny2.1.0将筛选出的药物靶点数据分别与PCOS及IR疾病靶点数据取交集得到共有靶点，分别获得半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR的作用靶点，将半夏泻心汤加减治疗PCOS的靶点和半夏泻心汤加减治疗IR的靶点取交集获得治疗两疾病的共有靶点，进行后续分析。

1.4 蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络构建与关键靶点筛选

将药物与疾病的共有靶点数据导入String数据库(https://string-db.org/)进行PPI网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，设置隐藏游离点，构建PPI网络图。将从String数据库获得的tsv文件导入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析，使用Network Analyzer工具进行拓扑分析，以连接度(degree)、介度(betweenness centrality)、紧密度(closeness centrality)等参数为参考条件，按照degree值由高至低进行排序，选取分值大于中位数的基因作为关键靶点。使用Cytoscape 3.7.2软件构建PPI网络，对其网络进行分析，并设置节点(node)大小和颜色用于反映degree的大小。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)富集分析、京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

将筛选出的核心靶标输入DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，Bonferroni法校正原始P值得到校正P值(adjP)，以adjP<0.01及错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.01作为条件，筛选关键核心靶标最显著富集的生物过程和通路信息，以期得到药物靶点主要的生物学注释和药理作用通路。

1.6 实验验证

1.6.1 实验动物 21日龄雌性SD大鼠18只，由北京华阜康生物技术有限公司提供，实验动物许可号：SCXK(京)2019-0008。饲养于中国中医科学院广安门医院动物实验中心，喂养饲料分普通饲料(供能比：蛋白质22.47%，脂肪12.11%，碳水化合物65.42%)与高脂饲料(供能比：蛋白质19.5%，脂肪23.8%，碳水化合物56.7%)。动物实验经中国中医科学院广安门医院实验动物伦理委员会批准进行(批号IACUC-GAMH-2017-002)。

1.6.2 药物及试剂 半夏泻心汤加减(清半夏、黄芩、黄连、干姜、党参、甘草、大枣、仙灵脾、枸杞子)由中国中医科学院广安门医院中药新药制剂研发中心提供；来曲唑片(弗隆)(规格：2.5mg/片)，购自诺华制药有限公司；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，货号：20181203)；白细胞介素-6 (interleukin- 6,IL-6)ELISA试剂盒(欣博盛生物有限公司，货号：ERC003.96)；IL-6抗体(RD SYSTEMS公司，货号：MAB5061-100)。

1.6.3 分组、造模及给药 SD 大鼠随机分为空白组(A组)、模型组(B组)及中药组(C组)，每组各6只，空白组予普通饲料喂养，其余各组给予高脂饲料联合来曲唑造模，造模后大鼠血清睾酮 (testosterone, T)、黄体生成素(luteinizing hormone, LH)/卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)比值升高，卵巢病理切片示卵巢出现多囊样改变，血清胰岛素抵抗指数(homeostasis model of assessment for insulin resistence index,HOMA-IR)显著高于空白对照组则提示PCOS-IR大鼠造模成功[19]。造模成功后，中药组使用半夏泻心汤加减进行干预14天。给药期间空白对照组予普通饲料，余组予高脂饲料。

1.6.4 标本采集及实验方法 给药结束后，各组大鼠禁食12小时进行取材。血液标本冰上静置，离心，分离血清进行酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验。取大鼠卵巢组织进行蛋白质印迹(western blot,WB)实验。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 半夏泻心汤加减活性成分筛选与靶点预测结果

半夏泻心汤加减的成分收集自TCMSP数据库，其中半夏中含有116个，黄芩中含有143个，黄连中含有48个，干姜中含有148个，党参中含134个，甘草中含有280个，大枣中含有133个，淫羊藿中含有130个，枸杞子中含有188个。依根据药物代谢动力学相关参数，将口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness,DL)≥0.18为选择条件[20]，运用UniProt数据库对从TCMSP数据库筛选出的活性成分对应的潜在靶点信息进行检索，规范靶点基因名，剔除无对应靶点成分并去重。结果共收集到82个生物活性成分。其中半夏7个、黄芩14个、黄连8个、干姜5个、党参11个、甘草22个、大枣16个、淫羊藿12个、枸杞子10个。通过对82个活性化合物构建中药-活性成分-靶点网络(见图1)，并依据节点的degree值进行节点大小的调节。82个活性化合物共有286个预测靶点。对应靶点最多的五个化合物分别为槲皮素(E1)、β-谷甾醇(E2)、山奈酚(B2)、木犀草素(B1)、豆甾醇(E3)。见图1、表1及表2。

注：九个圆形粉色节点代表九味中药；浅蓝色节点代表药物对应的活性成分；深蓝色节点代表中药成分对应的靶点；左右两列的六边形节点代表多个中药共有的活性成分。中药简称-全称对应关系见表1，中药共有的活性成分对应全称见表2。

表1 中药简称-全称对应关系

表2 中药共有的活性成分对应全称

2.2 PCOS及IR的疾病靶点筛选结果

PCOS在GeneCards数据库检索获得4847条相关基因，Drugbank数据库检索获得32条相关基因，Disgenet数据库获得988个基因。IR在GeneCards数据库检索获得8707条相关基因，Disgenet数据库获得162个基因。靶点过多则设置选取Relevance score大于中位数的目标靶点。将上述数据库检索获得的基因数据汇总并删重后，共获得2851个PCOS疾病相关基因、4362个IR疾病相关基因。

2.3 半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR靶点预测结果

将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入Venny 2.1.0软件，获得药物与PCOS及IR的交集靶点数目分别为195、252个，作为药物作用于疾病的预测靶点。将上述195个PCOS的靶点和252个IR的靶点再取交集获得191个半夏泻心汤加减治疗PCOS与IR的共有靶点。见图2。

图2 半夏泻心汤加减治疗PCOS与IR共有靶点韦恩图

2.4 半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR潜在靶点网络构建

将上述获得的191个共有靶点输入String平台构建PPI网络图，物种选择“Homo sapiens”，隐藏游离节点后包含190个节点，4358条边，平均degree为45.9，见图3。将PPI网络数据导入 Cytoscape 3.7.2中进行拓扑特征分析，按照degree值由高至低进行排序，选取分值大于中位数的基因作为关键靶点，根据该原则进行一次筛选，最后得到半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR关键靶点。degree越大，节点图形面积越大，颜色越暖；节点间相互作用强度越大，节点连线越粗，颜色越暖。degree得分最高的前5位分别为ALB、AKT1、TNF、IL6、TP53。见图4。

图3 半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR的PPI网络图

图4 筛选后的半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR的PPI网络图

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析结果

2.5.1 GO富集分析结果 GO富集分析是注释基因及其表达产物的常用方法。它主要分为生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(Cell components,CC)三部分。通过GO分析有助于了解药物靶点的生物学功能、作用方式及细胞定位等[21]。利用生物学信息注释(database for annotation, visualization and integrated discovery,DAVID)数据库对药物疾病共有靶点进行GO富集分析，共富集到783条生物过程相关条目，89条分子功能相关条目，141条细胞组分相关条目。根据参与分子数分别选取前20位的生物学过程、细胞组分、分子功能并使用微生信(Heatmap was plotted by http://www.bioinformatics.com.cn, a free online platform for data analysis and visualization.)绘制条形图(见图5)。涉及的生物学过程主要包括RNA聚合酶II启动子的转录正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、药物反应(response to drug)、信号转导(signal transduction)、凋亡过程的负调控(negative regulation of apoptotic process)、细胞增殖的正调控(positive regulation of cell proliferation)等；细胞组分主要包括细质膜(plasma membrane)、细胞核(nucleus)、胞液(cytosol)、细胞质(cytoplasm)、细胞外间隙(extracellular space)等；分子功能主要包括蛋白结合(protein binding)、酶位点结合(enzyme binding)、相同的蛋白结合(identical protein binding)、蛋白同源二聚体化活性(protein homodimerization activity)、ATP结合(ATP binding)等。

图5 预测靶点基因功能富集图

2.5.2 KEGG通路富集分析结果 KEGG通路富集分析可以分析药物靶标(或差异表达基因)的信号通路，便于了解在疾病过程中发生变化的信号通路，在探索疾病治疗上具有重要意义[17]。利用DAVID数据库对药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，选择校正后P≤0.05的条目，共富集到125条信号通路。选择参与分子数排名前20位的通路并使用微生信(Heatmap was plotted by http://www.bioinformatics.com.cn, a free online platform for data analysis and visualization.)绘制条形图(见图6)。参与的通路主要包括癌症通路(pathways in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌症中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、人类嗜T细胞病毒感染(HTLV-I infection)、粘着斑(Focal adhesion)、癌症中的MicroRNA(MicroRNAs in cancer)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)等。

图6 预测靶点信号通路富集图

2.6 ELISA法检测大鼠血清IL-6水平的统计结果

IL-6是半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR潜在靶点中degree值排名前五的靶点之一。本实验造模后，与空白组相比，模型组大鼠血清IL-6水平明显上升(P<0.05)，使用半夏泻心汤给药干预后，中药组大鼠血清IL-6水平明显下降(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6水平的比较

2.7 WB法检测大鼠卵巢组织IL-6蛋白表达情况的统计结果

与空白对照组相比，模型组大鼠卵巢组织IL-6蛋白的表达水平明显上升(P<0.05)，使用半夏泻心汤给药干预后，中药组大鼠卵巢组织IL-6蛋白的表达水平明显下降(P<0.05)。见图7、表4。

图7 Western blot法检测大鼠卵巢组织IL-6的表达水平

表4 各组大鼠卵巢组织IL-6蛋白的表达情况比较

3 讨论

PCOS是涉及多个系统的常见妇科疾病，在育龄期妇女中的患病率可达8%～13%，是导致育龄期妇女不孕的主要原因[22]，严重危害女性的身心健康，且其远期并发症多[23-24]。IR在多种内分泌代谢类疾病中广泛存在，属于T2DM、代谢综合征(metabolic syndrome, MetS)、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic Fatty Liver Disease，NFALD)、肥胖症(Obesity Syndrome，OS)等代谢性疾病的重要发病机制之一[25]。因此，IR不仅是PCOS患者发生生殖功能紊乱及代谢异常的重要环节，且IR的疾病进展与PCOS的远期并发症存在交集。因此，应尽早干预以防PCOS及IR患者内分泌紊乱的程度加剧。

中医中药在治疗PCOS及IR等方面疗效显著，具有广阔的发展前景。研究表明，滋肾清热利湿化瘀方具有改善PCOS患者自发排卵、降低血清T的作用[26]；姜黄联用二甲双胍能改善PCOS IR患者的生殖激素紊乱状态及胰岛素敏感性[27]；固本化瘀法具有改善肥胖型PCOS大鼠卵泡发育及IR的作用[28]；半夏泻心汤能改善PCOS患者生殖功能紊乱的状况[29]，也能改善糖尿病大鼠血糖及IR水平[30]。

本研究通过TCMSP平台筛选后得到半夏泻心汤加减的82个活性化合物，对应靶点最多的五个化合物分别为槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素、豆甾醇。槲皮素是一种类黄酮化合物，广泛存在于多种中药内，具有清除氧自由基、调节血糖等生物活性。研究发现槲皮素可以增加PCOS大鼠治疗后的正常卵泡数目，恢复正常卵巢组织结构，改善IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子的水平；同时可降低PCOS患者血清T、LH水平。此外，槲皮素有较好的降糖作用，能够改善高胰岛素血症及IR水平[31-32]；其改善IR的作用可能是通过增加骨骼肌GLUT4表达，降低JNK磷酸化、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶表达达到的[33]。β-谷甾醇具有抗炎[34]、抗氧化应激[35]及抗肿瘤[36-37]的功效；能显著改善PCOS组大鼠的子宫和卵巢结构，还可以协调大鼠的性激素水平、调整肠道菌群结构。山奈酚能降低T2DM大鼠空腹血糖、提高胰岛素敏感性、改善糖脂代谢紊乱；同时可以抵抗机体的炎症反应，且炎症因子水平与PCOS雄激素水平存在正相关关系[38]，因此山奈酚也能在一定程度上改善PCOS症状。木犀草素可以使PCOS大鼠发情周期正常化，减少囊状扩张卵泡及黄体丢失、降低LH和T水平；能通过上调PI3K p85α及pAKT蛋白水平、改善IR；还能恢复Nrf2通路、增强大鼠的抗氧化反应，在治疗PCOS方面具有一定潜力[39]。豆甾醇能显著减轻T2DM小鼠的IR水平、改善空腹血糖及血脂。此外，豆甾醇改善IR可能与增强小鼠骨骼肌和白色脂肪组织中的GLUT4的表达有关[40]。综上，半夏泻心汤加减改善PCOS及IR是通过多靶点、多途径的。

本研究PPI网络分析显示，半夏泻心汤加减治疗PCOS及IR的关键作用靶点包括ALB、AKT1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-6、TP53等。Akt1即蛋白激酶 B(AKT/PKB)的亚型之一，在多种组织中表达，是PI3K/AKT信号通路中的关键蛋白，活化的Akt可通过多种途径调控胰岛素的代谢，PI3K/AKT信号转导障碍在IR及PCOS的发生、发展中具有重要影响[41]。研究发现肥胖、MetS及PCOS患者体内存在慢性炎症反应，促炎因子TNF-α、IL-6等又可以诱导IR的发生，IR属于PCOS的重要病理表现[42-43]。PCOS大鼠模型血清中TNF-α、IL-6水平较正常组明显升高[44]。高水平的IL-6 水平会刺激PCOS大鼠的脂肪细胞，激活AKT/STAT3 信号通路，促进脂肪细胞增殖，加重代谢紊乱[45-46]。由此推测半夏泻心汤加减可能是通过改善TNF-α、IL-6等炎症因子、调节胰岛素信号通路达到治疗PCOS及IR的目的。有研究发现T2DM患者的胰岛素、ALB等水平升高，但ALB与PCOS、IR之间的关系尚缺乏研究证据，需进一步观察探索[47]。抑癌基因TP53位于17号染色体的短臂上(17p13)。癌症中普遍存在TP53体细胞突变及TP53蛋白(p53)失活。多达50%的人类肿瘤存在两个TP53等位基因的突变。PCOS及IR患者与TP53基因的关系仍有待深入研究[48]。因此，半夏泻心汤加减调控PCOS及IR的生物过程可能有TNF-α、IL-6、AKT1等因子的参与。本研究采用实验证实半夏泻心汤加减能够降低PCOS IR大鼠血清IL-6的表达及大鼠卵巢组织的IL-6蛋白表达水平。从分子机制为半夏泻心汤加减改善PCOS IR提供了依据。

KEGG通路分析显示，半夏泻心汤加减可调控癌症、乙型肝炎、PI3K-Akt、MAPK、TNF等信号通路。PCOS患者存在子宫内膜孕激素抵抗现象，可导致子宫内膜容受性下降，显著增加子宫内膜不典型增生和癌症发生的风险[49]。有研究观察了423例代谢综合征的患者，其中，感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)患者的空腹血糖(fasting blood glucos,FBG)、HOMA-IR高于未感染HBV的患者，提示HBV感染可能与IR发生有关[50]；但乙型肝炎与PCOS的联系还有待研究。TNF可参与全身的炎症反应，多由活化的巨噬细胞产生，TNF与受体结合后会触发NF-κB等途径的激活。NF-κB及MAPK信号通路与IR的发生有关[51]，同时，PCOS患者也存在NF-κB、MAPK等信号通路传导异常的状态[52-53]。分析结果说明半夏泻心汤加减可能通过调节炎症反应、糖代谢等过程改善PCOS及IR。

综上所述，本研究借助网络药理学与生物信息学等从“异病同治”角度探讨了半夏泻心汤加减治疗PCOS和IR的共同机制，结果提示中医药改善疾病具有多靶点、多通路的途径，为临床运用半夏泻心汤加减治疗PCOS和IR提供了一定的依据。但是网络药理学方法论仍存在局限性，如不同数据库内容的差异、中药成分在煎煮时发生的复杂变化等。因此，后续仍需进行实验研究来明晰半夏泻心汤加减治疗PCOS和IR的具体作用机制。