家蚕BmMet2基因的组织定位与激素诱导表达分析

童春梅， 易文瑾， 马 琼， 邓惠敏， 朱子丹

(华南师范大学生命科学学院/华南师范大学昆虫科学与技术研究所/广东省昆虫发育调控与应用重点实验室， 广州 510631)

昆虫的变态发育主要由保幼激素(Juvenile Hormone,JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)共同调控。JH几乎存在于所有昆虫的幼虫期,在变态前维持个体生长发育水平,阻止幼虫提前成熟变态[1-2]，而JH在幼虫末龄期的下降则使20E可诱导蜕皮变态[3]。JH在昆虫的发育过程中具有重要作用,然而JH信号通路的分子作用机制研究经历了漫长的时间,主要原因为其JH受体难以确定[4]。

经过多年的研究,学者们发现了2个JH可能的受体：Met(Methoprene-tolerant)[4-7]和gce(germ-cell express)[8-9]。Met是一个能编码bHLH-PAS结构域从而结合DNA的转录因子，最早是在果蝇(Drosophilamelanogaster)中发现并克隆的[5]。随后，在尖音库蚊(Culexpipiens)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)和赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)等昆虫中也克隆到了DmMet相应的同源体，这些同源基因所编码的蛋白都含有典型的bHLH-PAS结构域，暗示Met在不同昆虫中的功能可能比较保守[6-7]。 后期研究发现：果蝇中还存在另一个JH可能的受体gce，其基因序列与Met具有高度同源性，且同样编码一个含有bHLH-PAS结构域的转录因子，可以与DmMet形成同源或异源二聚体[8-9]；在果蝇中，gce能够在体内发挥Met的作用[10],且只有在Met和gce同时突变时果蝇才致死，二者都具有在幼虫蜕皮时通过诱导Kr-h1的表达来阻止20E诱导的组织细胞凋亡的功能[11]。在赤拟谷盗中，利用RNAi技术对TcMet进行干扰，结果使得赤拟谷盗幼虫产生了对JH的抗性，并引起了幼虫的早熟变态[7,12]。这一结果表明：TcMet在赤拟谷盗JH通路中起着重要的信号传导作用。通过比对家蚕基因组数据库发现，在家蚕中有2个果蝇Met同源基因，分别为BmMet1和BmMet2[13]。本实验室前期已经对BmMet1进行了克隆和表达定位分析，结果显示：BmMet1基因mRNA的转录和蛋白表达均在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中呈现较高水平，而在蛹期呈现较低水平，且受到JH类似物Methoprene的诱导上调表达[14]，所以本文主要以BmMet2为研究对象。

家蚕翅原基在5龄之前生长缓慢，在5龄中期迅速发育，其5龄后期时的大小形态已基本接近蛹期[15]，表明5龄时期的翅原基发育主要受JH的调控。然而，被认为是JH受体的Met2是否参与翅原基的发育过程仍不清晰，本研究通过比对家蚕基因组数据库，找到了果蝇Met和gce的同源基因BmMet2[13]，克隆表达了BmMet2中能与DNA结合的蛋白区域BmMet2DBD，并制备了可特异性识别BmMet2的抗体，利用蛋白质印迹法(Western blotting)检测了BmMet2在翅原基各时期的表达，免疫组化检测了BmMet2在各组织中的定位表达情况，以期为研究BmMet2作为JH的受体是否参与调控家蚕的生长发育(尤其是翅原基发育)提供基础，以及为阐明昆虫变态发育的分子调控机制、促进蚕丝产业的发展和为鳞翅目害虫防治等提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的家蚕品种为大造，由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所提供。在温度26±1 ℃、相对湿度为65%～75%、光周期为12 h∶12 h (光∶暗)的培养箱中，用新鲜采摘的桑叶饲养幼虫。

1.2 方法

1.2.1 激素处理与基因表达量检测 选取5龄第3天的家蚕，在其第2、3胸节处分别注射2 μg的JH类似物Methoprene或20E，另外注射相同体积的w=0.1%的DMSO 作为对照组。在1、2、4、8、16、32 h后分离翅原基。按Trizol Isolate抽提试剂盒的说明提取家蚕组织RNA，然后按照TAKARA公司的M-MLV反转录试剂盒说明书，反转录合成cDNA，制备家蚕各发育时期(5龄第3天至蛹期第3天)翅的cDNA和激素处理后翅的cDNA。根据序列设计PCR引物(表1)，参照荧光定量PCR试剂盒的方法，进行PCR反应，检测BmMet2的表达。

表1 本研究所使用到的引物Table1 The primers used in this study

1.2.2 基因克隆与表达载体构建 根据序列设计PCR引物(表1)，以家蚕cDNA为模版，进行PCR扩增。将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到E.coliDH5α菌体中，筛选阳性克隆进行测序确认。用EcoRⅠ和XhoⅠ对BmMet2DBD片段和pProEx-HTa进行双酶切，胶回收后将回收片段进行连接，构建BmMet2DBD-pProEx-HTa表达载体，然后转化至DH5α中。将过夜培养后的细菌按1∶100的体积比加入LB液体培养基中，培养条件为37 ℃、220 r/min；当菌液的OD值达到0.4～0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养4 h。实验对照为相同培养条件下的不含目的基因的空载。4 ℃、12 000 r/min离心1 min收集菌体，超声波进行破碎，离心后分别收集上清液和沉淀。最后进行w=10%的SDS-PAGE凝胶电泳后考马斯亮蓝R250染色分析。

1.2.3 抗体制备及检测 将500 μg 溶于PBS的BmMet2DBD重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂充分混合。用注射器抽取乳化液，皮下注射新西兰大白兔；每隔一个星期，用300 μg蛋白与弗氏不完全佐剂的混合液对兔子进行3次加强免疫。在第3次加强免疫7天后，在兔子耳朵静脉近末端抽取血液。采集的血液在37 ℃培养箱中放置1 h，然后在4 ℃条件下放置过夜；第2天，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，分装放在-80 ℃冰箱保存备用，用Western blotting检测抗体效价。

1.2.4 Western blotting实验 使用w=10%的SDS-PAGE电泳分离蛋白，每一个泳道蛋白上样量为15 μg。使用电转系统将分离胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，随后将膜放入w=3%的BSA中4 ℃封闭过夜，按1∶1 000的比例加入BmMet2抗体，37 ℃孵育1 h。用洗脱液洗膜3次去除未结合的抗体。以1∶10 000稀释比例加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG酶标抗体，于37 ℃孵育1 h。洗脱液洗膜4次后用四唑硝基蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)混合进行显色。

1.2.5 BmMet2在家蚕组织中表达的免疫组化分析 将5龄第6天、吐丝期及预蛹期的家蚕置于冰上，等其冻至休克后从头部注入φ=4%的多聚甲醛，随后分别取其第2、3胸节放入φ=4%的多聚甲醇固定过夜。将固定好的样品分别用φ=50%，70%，85%，95%，100%的乙醇梯度脱水，每次1 h，最后用φ=100%的二甲苯透明。将上述处理好的样品在60 ℃的石蜡中渗蜡2 h，将熔化好的石蜡与组织放进包埋架中调整好位置，等石蜡凝固，4 ℃冷却后即可取出蜡块进行切片。

将切片于二甲苯和乙醇梯度体积分数下脱蜡，使用φ=3%的H2O2室温下孵育5 min，20 mg/mL蛋白酶K反应15 min；用预冷的0.2 mol/L甘氨酸溶液孵育2 min；孵育后用PBS缓冲液洗5 min，共洗3次；用w=5%的BSA的封闭液37 ℃下孵育过夜；用PBS 洗涤3次；按1∶200的比例加入一抗(可特导性识别BmMet2的抗体)，在37 ℃中孵育1 h；用PBS 洗5 min，共洗3次；每一块载玻片上加入40～50 μL 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔的二抗和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)的混合液，避光孵育30 min；PBS洗涤5 min，共洗3次；最后，在倒置荧光显微镜下观察。

2 实验结果

2.1 家蚕 BmMet2蛋白的序列分析

从NCBI上获得BmMet2蛋白序列(Accession number:NP_001108457.1)，用SMART软件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)对家蚕BmMet2的蛋白序列进行分析预测。结果(图1)显示：BmMet2编码1个bHLH-PAS型转录因子和1个PAC基序。bHLH是能与DNA结合的结构域，而PAS结构域能与其他bHLH-PAS超家族成员发生蛋白-蛋白相互作用。这暗示了BmMet2能与DNA结合并与其他转录因子互作，共同调控下游基因的表达。

图1 BmMet2蛋白的序列分析

2.2 BmMet2时期表达谱及激素诱导表达分析

qRT-PCR结果(图2A)表明：在翅原基中，BmMet2在 5龄第3天和5龄第6天有较高水平的表达；到游走期，其表达水平有些下降；化蛹后，其表达水平持续下降，至蛹期第3天时已下降到较低水平。这一表达变化趋势与保幼激素JH在家蚕体内的滴度变化趋势[16]相一致，表明BmMet2可能参与JH对翅原基发育的调控。激素处理实验结果(图2B)显示BmMet2均受到JH和20E的诱导表达且JH类似物Methoprene的诱导作用更明显：(1)在JH注射后1～2 h,BmMet2表达上调;处理2 h后，激素诱导效应不再明显。(2)注射20E 1 h后亦可诱导BmMet2表达，至2 h时则显著抑制表达。这些结果表明，BmMet2可能作为JH的响应因子，参与了JH对翅原基发育的调控，且也能受20E的诱导表达，在复杂的JH和20E互作网络中也可能发挥重要的作用。

图2 BmMet2在翅原基中的时期表达谱及激素诱导表达分析

2.3 重组蛋白BmMet2DBD的原核表达及多克隆抗体的特异性

根据NCBI上BmMet2(Accession number:NM_001114985.1)的cDNA序列设计引物，扩增BmMet2中能与DNA结合的序列(BmMet2DBD)(图3A)，经过w=1%的凝胶电泳分离后，在1 000 bp附近显示出一条特异性条带，与预测条带长度1 062 bp相符，经序列测定证明克隆的序列正确(图3B)。对BmMet2DBD进行结构分析，BmMet2DBD具有1个HLH结构域、1个PAS结构域和1个PAC基序。

图3 BmMet2DBD的cDNA序列和PCR扩增产物

将重组质粒BmMet2DBD-pProEx-HTa转化入DH5α，经IPTG诱导4 h后，收集细菌进行超声波破碎离心，分离上清液和沉淀用于SDS-PAGE检测。pProEx-Hta含有1个His标签，其相对分子质量为3 000，而BmMet2DBD重组蛋白的相对分子质量约为38 400，所以预测重组表达蛋白的相对分子质量约为41 400。结果(图4A)显示：重组质粒表达出重组蛋白，其相对分子质量与预测相对分子质量(41 400)非常相近，这表明BmMet2DBD重组蛋白在原核系统中成功表达，且主要以包涵体的形式存在于沉淀中。

用BmMet2DBD重组蛋白免疫新西兰大白兔后，获得相应的BmMet2DBD多克隆抗体，并用BmMet2DBD-pPROEX-HTa转化的细菌总蛋白进行Western blotting实验，对抗体进行专一性分析。结果(图4B)表明所制备的抗体能很好地识别抗原蛋白：制备的抗体能检测到BmMet2DBD-pPROEX-HTa转化的细菌总蛋白中的特异性蛋白条带，而在pPROEX-HTa菌体总蛋白中没有检测到蛋白条带。

图4 重组蛋白 BmMet2DBD的表达及BmMet2DBD抗体的专一性分析

2.4 BmMet2蛋白在家蚕各发育时期翅原基中的表达

为探究BmMet2的功能，用Western blotting检测了BmMet2在家蚕不同发育时期翅原基组织中的表达，每一个泳道蛋白上样量均为15 μg。结果(图5)显示：从家蚕5龄第3天到熟龄期，BmMet2的表达量逐渐升高；在游走期第1天和预蛹期，其表达量达到峰值；预蛹期后，其表达量逐渐降低。游走期和预蛹期是家蚕变态发育的重要时期，BmMet2在这2个时期的高表达说明其很可能是参与调控家蚕变态发育的重要的转录因子。

图5 BmMet2蛋白在家蚕翅原基中各个时期表达的分析

2.5 BmMet2蛋白的组织定位

为了确定BmMet2蛋白在家蚕组织中的定位，选取5龄第6天、吐丝期和预蛹期的家蚕制备石蜡切片，用荧光免疫组织化学的方法检测BmMet2蛋白在蚕体主要部位的表达。结果表明：BmMet2蛋白在幼虫5龄第6天和吐丝期的家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基的翅囊和翅芽等组织中都有表达，其中在胸节表皮、脂肪体和翅原基的翅囊等组织部位的表达量较高，在翅原基的翅芽部位的表达量较低(图6A、B)；BmMet2蛋白在预蛹期的家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基的翅芽等组织中也有表达，但在翅芽部位的表达量高于幼虫5龄第6天和吐丝期的(图6C)。总体来看，BmMet2蛋白在这3个时期都有较高的表达水平，且表达趋势与Western blotting检测蛋白质的表达趋势基本吻合。

图6 BmMet2蛋白在不同发育时期和组织中的免疫组织化学定位分析

3 讨论与结论

昆虫的变态发育主要由20E和JH通路协同调控的。目前，关于20E是如何调控昆虫蜕皮、变态的分子机制已比较清楚[16]，而JH调控昆虫生长发育的分子机制还不是很明确，尤其是其受体和下游调控基因的鉴定较少。Met基因具有典型的DNA结合结构域，果蝇DmMet可以与JH主要种类(JHIII)特异性结合，并具有很高的亲和力。在赤拟谷盗中，RNAi干扰TcMet的表达，使得赤拟谷盗幼虫无法响应JH的调控，并导致了幼虫的早熟变态[7,12]，在家蚕中亦有研究表明JH通过与Met和SRC形成复合体，调控JH初级应答因子Kr-h1的转录[9]。表明Met可能是JH的受体，并在JH通路中起重要的调控作用。

为了进一步研究BmMet在家蚕生长发育过程中的作用，本文对BmMet2蛋白进行了结构分析，用qRT-PCR检测了BmMet2在家蚕翅原基组织中的表达情况及其对昆虫激素的响应情况；克隆表达了BmMet2中能与DNA结合的蛋白区域BmMet2DBD；制备了可特异性识别BmMet2的抗体，利用该抗体进行Western blotting和免疫组化实验，检测了BmMet2在家蚕各个组织各个时期中的定位表达情况。主要结论如下：

(1)蛋白结构分析结果显示：BmMet2属于bHLH-PAS转录因子，含有可与DNA结合的bHLH、可与蛋白互作的PAS及PAC结构域。此结果与黑腹果蝇的Dmgce与DmMet都含有bHLH和PAS结构域的结论[6,17]一致。在埃及伊蚊和赤拟谷盗等昆虫基因组中也鉴定出Met相应的同源基因，发现这些基因都含有典型的bHLH-PAS结构[7]，说明Met在不同昆虫中的功能可能是比较一致的。果蝇Met和gce可以相互结合形成Met-Met和Met-gce同源或异源二聚体[8]，这些结果暗示BmMet2可能以同源或异源二聚体的形式参与调控靶基因的表达。

(2)在翅原基中，BmMet2在5龄第3天和5龄第6天有较高水平的表达，随后表达量降低，其表达模式与家蚕5龄幼虫发育过程中JH的滴度相吻合[18]，且家蚕5龄时期翅原基的发育主要受JH的调控[15]，暗示BmMet2参与了5龄幼虫的发育过程，并对翅原基的发育有重要的作用。另外，本研究还发现BmMet2蛋白在5龄第6天、吐丝期和预蛹期的家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基的翅囊和翅芽等组织中都有较高表达。游走期和预蛹期是家蚕变态发育的重要时期，BmMet2在这2个时期的高表达说明其很可能是参与调控家蚕变态发育的重要的转录因子。

(3)进一步激素处理结果表明BmMet2可能参与了JH对翅发育的调控，在20E和JH的信号通路过程中发挥作用：BmMet2的表达受到昆虫激素Methoprene和20E的诱导，Methoprene的诱导作用比20E的作用更为明显；2种激素均在注射2 h内诱导基因表达的上调。RIDDIFORD[19]的研究表明Met与FKBP39、Chd64相互作用,并结合于JH应答元件(JHRE)上，从而诱导JH应答基因的大量表达，并与20E诱导的基因一起调控昆虫的幼虫蜕皮。LI等[20]在研究果蝇时发现，当仅存在20E时，Met可与EcR-USP受体二聚体相互作用形成复合物，然后结合于20E的反应元件上，调控20E所诱导的靶基因的转录表达。这些前期研究结果与本文得到的2种激素均能诱导BmMet2表达的结果相一致，表明20E受体二聚体EcR-USP和JH受体Met在20E和JH的协同作用中发挥至关重要的调控作用。Met通过JH和20E信号通路调控着昆虫的生长发育，但其具体的分子作用机制还需进一步深入研究。

综上所述，本文对转录因子BmMet2的研究有助于阐述昆虫变态发育的过程，也有助于完善昆虫激素对翅原基发育的分子调控机制。