天香丹胶囊调控雌激素核效应抗心肌缺血作用研究

杜古加·嘎尔玛，姜 林，王慧敏，吉 钊

（1新疆医科大学第四临床医学院，2省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，3新疆中药炮制研究重点实验室，乌鲁木齐 830000）

缺血性心脏病又称为冠心病，是由冠状动脉粥样硬化引起的血管腔狭窄或阻塞，进而引发冠状动脉功能性改变，导致心肌缺血、缺氧，进一步加重心肌损伤，诱发心绞痛，严重者可引起心肌梗死，此病发病率、病死率均较高[1]。现代医学根据冠心病患者病情的缓急对应采取不同治疗方法，药物治疗可缓解患者气短、胸痛、心悸等临床症状，冠脉支架植入和搭桥手术可以改善冠状动脉不同程度的狭窄[2]。研究表明，雌激素可以提高血管内皮生长因子的产生，改善心脏缺血后的功能，提高心脏收缩能力，有效恢复心肌缺血后血流量。雌激素核效应是指雌激素进入细胞核后与雌激素核受体结合后发生的相应反应，雌激素核效应是雌激素信号通路中的一条关键途径[3]。中医药学研究表明，中药治疗冠心病疗效确切，安全性高，不良反应少[4]。心肌缺血在中医上属血瘀证的范畴，归于“胸痹”[5]。天香丹胶囊是新疆医科大学附属中医院院内制剂，主要成分为降香、丹参、芳香新塔花、红景天，临床主要用于胸痹、秽浊痰阻证型冠心病的治疗，也可长期用于心肌缺血的治疗[6-8]。本研究采用去卵巢心肌缺血再灌注大鼠模型，探究天香丹胶囊调控雌激素核效应发挥抗心肌缺血的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器HX-300S 型小动物呼吸机（成都泰盟有限公司）；BL-420S型生物机能实验系统（成都泰盟有限公司）;冷冻研磨仪（上海净信有限公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司)；酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药天香丹胶囊（新疆医科大学附属中医医院院内制剂，批号20190816）；17β-雌二醇（美国Sigma公司，批号E1024）；雌激素（Estrogen）ELISA检测试剂盒（上海优选生物科技有限公司，批号YX-E21147）；肌钙蛋白I（cTnI，武汉纽康度生物科技股份有限公司，批号F2415），ELISA检测试剂盒（上海优选生物科技有限公司,YZ-E988025）；1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑染液（北京雷根科技有限公司,批号T8170）；4%多聚甲醛组织固定液（美国Biosharp 公司,批号BL539A）；核蛋白提取试剂盒（美国Solarbio 公司，批号 R0050）；ERα 抗 体 (美 国 Abclonal 公 司 ，批 号A12976)；HSP70 抗 体 (美 国 Abclonal 公 司 ，批 号A0284)；Bax 抗体(美国 Abclonal 公司，批号 A15646)；Bcl-2抗体 (美国Abclonal公司，批号A19693)。

1.3 动物SPF 级SD 雌性大鼠购自新疆医科大学实验动物中心（动物生产许可证号：SCXK20190003），10周龄，体重（200±50）g，适应性喂养7 d，饲养于新疆医科大学实验动物中心，室温（20±2）℃、相对湿度（55±5）%，光照明暗交替12 h/12 h。

1.4 分组及给药方法取SD 雌性大鼠70 只按体重随机分为7 组，空白组不去卵巢，生理盐水灌胃;去卵巢组去卵巢后，生理盐水灌胃，心脏左前降支下只穿线不结扎;去卵巢缺血再灌注组去卵巢后，生理盐水灌胃，可逆性结扎心脏左前降支使心肌缺血30 min，再灌注180 min；雌二醇干预组去卵巢后雌二醇（0.8×10-3g·kg-1·d-1）灌胃，可逆性结扎心脏左前降支让心脏缺血30 min，再灌注180 min；天香丹高、中、低剂量组去卵巢后（天香丹胶囊，0.8×10-3、0.6×10-3、0.2×10-3g·kg-1·d-1）灌胃，可逆性结扎大鼠心脏左前降支使心肌缺血30 min，再灌注180 min。每组每天灌胃1次，连续60 d。除空白组外，每组于去卵巢前、去卵巢后、再灌注末取血，分离血清，-80℃保存；取下心脏，置于生理盐水中，洗净置于-80 ℃备用保存；每组另取3只大鼠在再灌注末结扎左前降支，从腹主动脉注射2 mL2%伊文氏蓝染色液，肉眼可见心脏染色充分变蓝后，取下心脏，生理盐水冲洗，-80℃保存，用于心肌梗死面积测定。

1.5 指标测定及方法

1.5.1 大鼠不同时间段心电图ST段抬高情况监测 实验过程中采用心电图实时监测，记录各组大鼠Ⅱ导联心电图，观察缺血性心律失常的发生情况。模型成功为心电图ST 段显著抬高(＞0.5 mV)呈单峰的曲线，并且大鼠心肌组织颜色眼见为白色；再灌注模型成功为心电图ST 段下降，并且大鼠心肌组织颜色眼见恢复为红色，统计分析各组大鼠正常时、缺血时、缺血30 min、再灌注时、再灌注180 min 5 个时间点的ST段高度数值。

1.5.2 ELISA 法检测血清中雌激素和cTnI 水平 各组大鼠眼眶取血，3 000 r/min 离心15 min 后取上清液，采用双抗体夹心法分别测定正常时、去卵巢后各组大鼠血清中雌激素水平和灌胃60 d后cTnI水平。

1.5.3 大鼠心脏伊文氏蓝-2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色 取出经伊文氏蓝染色的心脏，自心底向心尖切成2～3 mm 环形薄片，将薄片在37℃,1%TTC染液中避光孵育15 min 后，用4%多聚甲醛固定。染色后正常心肌组织、危险区未梗死心肌组织和梗死心肌组织分别呈蓝色、红色和白色。对心脏切面扫描后，用Image J软件分析各区域面积。

1.5.4 心肌组织苏木精-伊红(HE)染色 用4%的甲醛固定左心室组织，梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，中性树胶封固。切片，用苏木精-伊红染色，于光学显微镜下拍照(×400)，用于组织形态学观察。

1.5.5 Western blot 检测心肌组织细胞核中ERα、HSP70、Bax、Bcl-2 蛋白的表达 用冷冻研磨机研磨组织，按试剂盒说明操作提取心肌组织细胞核蛋白，经10 %SDS-PAGE 凝胶电泳后转膜，洗膜，以5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入相应一抗ERα（1∶2 000）、HSP70（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，再次洗膜后加入HRP 标记的二抗,室温孵育膜2 h，洗膜后将显色液滴加在PVDF 膜上，曝光成像。

1.6 统计学处理采用SPSS 23.0 统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Duunett's T3法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间段心电图ST 段高度的比较正常时，各组比较ST段无统计学差异。缺血30 min，与空白组比较，去卵巢缺血再灌注组ST段抬高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与去卵巢缺血再灌注组比较，雌二醇干预组和天香丹高剂量组的ST段降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。再灌注30 min，与空白组比较，去卵巢缺血再灌注组的ST段抬高，差异有统计学意义（P＜0.05）;与去卵巢缺血再灌注组比较，雌二醇干预组和天香丹高、中、低剂量组ST 段高度降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。再灌注60 min，与空白组比较，去卵巢缺血再灌注组的ST段抬高，差异有统计学意义（P＜0.05）;与去卵巢缺血再灌注组比较，雌二醇干预组和天香丹高、中、低剂量组ST 段高度降低，有统计学意义（P＜0.05）。再灌注180 min，与去卵巢缺血再灌注组比较，雌二醇干预组和天香丹高剂量组ST 段高度降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、表1。

表1 各组大鼠心电图ST段高度的变化（）

注：与空白组比较，*P＜0.05;与去卵巢缺血再灌注组比较，#P＜0.05。

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图1 天香丹胶囊对去卵巢心肌缺血再灌注大鼠心电图ST段高度的影响

2.2 各组大鼠血清雌激素水平的变化去卵巢前各组大鼠血清雌激素水平差异无统计学意义（P＞0.05）；去卵巢后，与空白组比较，去卵巢组、去卵巢缺血再灌注组、雌二醇干预组、天香丹高、中、低剂量组大鼠血清雌激素水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清雌激素水平的变化（，pg/mL）

表2 各组大鼠血清雌激素水平的变化（，pg/mL）

注：与空白组比较，*P＜0.05。

组别空白组去卵巢组去卵巢缺血再灌注组雌二醇干预组天香丹高剂量组天香丹中剂量组天香丹低剂量组正常时浓度41.98±2.50 40.40±0.39 40.51±1.38 40.01±1.89 40.10±0.97 40.55±0.49 40.49±0.57去卵巢后浓度40.17±0.32 21.16±1.54*19.08±2.59*20.06±1.11*20.22±0.91*24.55±5.07*22.87±1.36*

2.3 各组大鼠血清cTnI 水平的变化与空白组比较，去卵巢缺血再灌注组血清cTnI 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）;与去卵巢缺血再灌注组比较，雌二醇干预组和天香丹高、中、低剂量组血清cTnI 水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠血清中cTnI水平的变化（，pg/mL）

表3 各组大鼠血清中cTnI水平的变化（，pg/mL）

注：与空白组比较，*P＜0.05;与去卵巢缺血再灌注组比较，#P＜0.05。

cTnI的水平122.51±5.72 155.02±10.62 468.08±25.70*209.27±27.93*#214.71±10.66*#256.87±13.38*#388.49±25.60*#组别空白组去卵巢组去卵巢缺血再灌注组雌二醇干预组天香丹高剂量组天香丹中剂量组天香丹低剂量组

2.4 各组大鼠心脏伊文氏蓝-TTC 染色结果与空白组比较，去卵巢缺血再灌注组的大鼠心脏梗死区面积增大，梗死区面积占危险区面积百分比升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与去卵巢缺血再灌注组比较，天香丹高、中、低剂量组和雌二醇干预组梗死面积减小，梗死区面积占危险区面积百分比降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 各组大鼠心脏梗死区/危险区面积比较（）

表4 各组大鼠心脏梗死区/危险区面积比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.05;与去卵巢缺血再灌注组比较，#P＜0.05。

组别空白组去卵巢组去卵巢缺血再灌注组雌二醇干预组天香丹高剂量组天香丹中剂量组天香丹低剂量组面积百分比/%3.81±0.98 15.45±2.87 49.35±9.57*35.91±7.41#37.73±4.17#40.74±4.35#43.62±4.31#梗死区面积3.24±0.94 12.62±1.82 40.58±3.87*29.47±4.07#29.04±3.52#32.98±3.08#36.28±3.80#危险区面积85.08±6.83 82.30±6.40 83.59±6.83 83.13±7.70 77.19±7.11 81.07±3.85 83.26±5.49

2.5 各组大鼠心肌组织HE 染色结果正常组与去卵巢组大鼠心脏组织细胞形态未见异常；与正常组比较，去卵巢缺血再灌注组大鼠心脏组织细胞呈现明显纤维化、间隙增宽、排列无序等病变；与去卵巢缺血再灌注组比较，雌二醇干预组和天香丹高、中、低剂量组大鼠心脏组织呈现出不同程度的改善，见图2。

图2 各组大鼠心肌组织细胞HE染色比较（×400）

2.6 各组大鼠心肌组织细胞核中ERα、HSP70、Bax、Bcl-2 蛋白表达水平的比较与空白组比较，去卵巢缺血再灌注组心肌组织细胞核中ERα、HSP70、Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平增高，Bcl-2/Bax降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与去卵巢缺血再灌注组比较，雌二醇干预组和天香丹高、中、低剂量组心肌组织细胞核中ERα、HSP70、Bcl-2 蛋白水平增高，Bax蛋白水平降低，Bcl-2/Bax增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3、表5。

图3 各组大鼠心肌组织细胞核中蛋白表达水平图

表5 各组大鼠心肌组织细胞核中蛋白表达水平（）

表5 各组大鼠心肌组织细胞核中蛋白表达水平（）

注：与空白组比较，*P＜0.05;与去卵巢缺血再灌注组比较，#P＜0.05。

Bcl-2/Bax 1.74±0.06 1.17±0.36 0.58±0.27*0.96±0.24#0.97±0.32#0.93±0.24#0.73±0.25#组别空白组去卵巢组去卵巢缺血再灌注组雌二醇干预组天香丹干预高组天香丹干预中组天香丹干预低组ERα/β-actin 1.00±0.03 0.36±0.17 0.35±0.18*1.08±0.06#0.68±0.17#0.58±0.25#0.51±0.29#HSP70/β-actin 1.00±1.22 1.0±0.18 1.78±0.06*2.64±0.12#2.10±0.25#1.35±0.32#1.17±0.34#

3 讨论

心肌缺血大鼠的心脏会丧失正常的功能，在心电图的ST 段相对正常时会显著抬高，心脏收缩力也会降低[9]。机体在心肌缺血再灌注损伤时，心肌细胞会释放出心肌损伤物质cTnI，它是临床用于诊断早期心肌梗死的指标[10]。研究发现，对心肌缺血动物模型进行外源性干预雌激素，可改善心脏功能，减少心肌细胞损伤，抑制心肌细胞凋亡进而减少心肌梗塞面积[11]。本研究实验结果表明，与大鼠正常时血清雌激素水平比较，去卵巢后血清雌激素水平显著降低；各组大鼠ST 段与正常时比较，缺血30 min 时ST 段显著抬高，说明大鼠去卵巢心肌缺血再灌注双模型建立成功。天香丹胶囊干预后，再灌注30、60、180 min时，雌二醇干预组和天香丹各剂量组心电图ST 段高度均降低，天香丹各剂量组血清中cTnI 水平均降低。此外，天香丹各剂量组心脏梗死面积和梗死区面积占危险区面积百分比均减小，心肌组织中细胞排列相对有序、细胞间隙较窄、细胞纤维化减少。以上结果说明，天香丹胶囊可有效缓解去卵巢心肌缺血再灌注大鼠的心肌缺血症状。

ERα 是配体依赖的类固醇核受体超家族成员,ERα 与雌激素等入核配体结合后引发雌激素核效应[12]。有研究表明，本实验药物主要有效成分丹参酮ⅡA、红景天苷等可作为雌激素受体的配体，激活雌激素受体引发雌激素样反应[13-14]。热休克蛋白70（HSP70）是机体损伤后产生的一种内源性保护因子，HSP70自身可促进受损心肌的快速恢复，维持细胞的正常功能[15-17]。HSP70 还可间接与雌激素受体结合，起到心肌保护的作用[18]，故在雌激素与ERα结合时细胞核内HSP70 水平显著增高。天香丹胶囊能够增加心肌组织细胞核中ERα、HSP70 的蛋白表达水平。Bcl-2和Bax是细胞凋亡家族蛋白中的基因，Bax是促凋亡基因，Bcl-2 是凋亡抑制基因，细胞中过表达的Bcl-2 与Bax 结合形成异源二聚体结构，可以减少细胞凋亡[19]。细胞凋亡的发生可由Bcl-2/Bax 的比值来判断[20]，本研究发现天香丹胶囊能够增加心肌组织细胞核中的Bcl-2 蛋白水平表达，减少Bax 的蛋白表达水平，进而Bcl-2/Bax比值增加，说明天香丹胶囊干预后心肌细胞凋亡的数量减少。

综上所述，天香丹胶囊药效成分激活ERα 后，在HSP70的辅助作用下形成同源二聚体，再结合到雌激素反应元件上调节转录因子的表达，使Bcl-2 蛋白表达水平增高，Bax 的蛋白表达水平降低，抑制心肌细胞凋亡。本研究由雌激素核受体ERα 介导发挥核效应，表现出抗心肌缺血作用，但在探索此通路的过程中还有许多细节和具体靶点尚不清楚，仍需进一步探索研究。