艾灸足三里穴对自然衰老大鼠睾丸miRNA表达谱的影响

张纾研，刘世敏△，赵 琛，赵舒羽，石健菲，李 潇

(1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437)

当前，人口老龄化已成为世界各国共同面临的难题。衰老是生物体组织、器官和细胞功能随年龄增长而退化的过程。延缓衰老、防治老年疾病一直是当前研究的热点课题。性腺结构和功能的退化与人类衰老密切相关，男性睾丸组织从中年开始出现退行性改变,随后出现结构萎缩和功能退化[1]。然而，睾丸衰老在发生机制和临床防治方面，尚存在很多问题有待阐明和解决[2]。性腺衰老与机体衰老有密切关系，其理论在中医学中早有涉及。《黄帝内经·上古天真论》中详细描述了男性由盛到衰的增龄性生理变化过程:“丈夫八岁，肾气实，发长齿更……四八，筋骨隆盛，肌肉满壮;五八，肾气衰，发堕齿槁;六八，阳气衰竭于上……故发鬓白，身体重，行步不正，而无子耳。”艾灸作为中医学传统疗法,在延缓衰老、调节机体功能中发挥了重要作用。《外台秘要》记载:“三里养先后天之气，灸三里可使元气不衰，故称长寿之灸”。

近年来,微小RNA(microRNA,miRNA)在各种疾病中的作用已成为研究的热点。miRNA是一类非编码小RNA，长度约为22个核苷酸。miRNAs参与基因调控，其通过调控靶基因参与细胞的增殖、分化和凋亡等多种生物学进程[3]。尽管衰老的因素多样而复杂，但目前已有研究证明miRNAs是随着衰老而显著上调或下调的，其中很多miRNAs已经被证实为在衰老机体、组织或细胞的调节因子[4]，这些进展提供了改变不同衰老信号通路和特定因素的理解。MicroRNA的网络调控特点与针灸多途径、多靶点、多水平和多层次等调节作用特点高度契合[5]。在本研究中，以雄性自然衰老大鼠为动物模型，以艾灸足三里穴为干预手段，采用Illumina Hiseq测序平台，比较分析睾丸组织microRNA表达情况，并运用多种生物信息学分析工具，对差异表达的miRNAs的靶基因进行功能富集分析，目的是通过研究艾灸对自然衰老大鼠睾丸组织miRNA表达的影响，探讨其可能的延缓睾丸衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与伦理

选取SPF级雄性SD大鼠，20月龄[由上海中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(沪)2013-0016]。以自然衰老(20月龄)雄性SD大鼠为衰老模型，大鼠随机分为老年对照组、艾灸组，另设青年对照组(9月龄)，每组10只。温度(24±2)℃，光暗周期为12 h：12 h，SPF级喂养，自由饮水。本实验严格遵照《中华人民共和国动物保护法》及上海中医药大学实验动物管理委员会制定的实验动物使用以及保护条款。

1.2 干预方法

艾灸组自14月龄起进行艾灸干预：采用固定器固定大鼠后，暴露其“足三里”穴，以直径5 mm艾条温和灸单侧“足三里”1次/d，每次20 min。两侧“足三里”穴位交替使用，连续6个月至20月龄。青年对照组与老年对照组：不作干预，只做与艾灸“足三里”穴组相同的抓取和固定。大鼠“足三里”定位(参考《实验针灸学》余曙光、徐斌主编)：位于大鼠后肢膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处。

1.3 主要试剂及仪器

TRIzol reagent(Life Technologies，美国);RNAScreenTape和RNA Reagent(Agilent Technologies，美国);High Sensitivity D1000ScreenTape 和High Sensitivity D1000 Reagent (Agilent Technologies，美国);Qubit®dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies，美国)；NEBNext®Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina®(NEB，美国);HiSeq Rapid SBS Kit V2(50 cycle)(America，美国);HiSeq Rapid SR Cluster Kit V2(Illumina，美国)。Agilent 2200 TapeStation(Agilent Technologies，美国)；ND-1000 Nanodrop(Thermo Fisher，美国)；Qubit 2.0(Life Technologies，美国)；Hiseq 2500(Illumina，美国)。

1.4 标本采集及处理

用2 %戊巴比妥钠(30～40 mg/kg)对各组大鼠进行腹腔注射麻醉，取出大鼠双侧睾丸，剥除周围脂肪组织及结缔组织，用生理盐水冲洗。用4 %多聚甲醛固定左侧睾丸24 h，右侧睾丸放于液氮中冻存1 h后保存在-80 ℃冰箱用于miRNA检测。左侧睾丸进行常规脱水、透明、石蜡包埋和连续冠状面切片，切片厚度4 μm。取部分石蜡切片置于60 ℃烘箱2 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木精染色2 min，1 %盐酸酒精分化，超纯水返蓝，0.5 %伊红复染30 s，最后梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片。每张切片观察6个视野。

1.5 miRNA检测

1.5.1 总RNA抽提的质控 用Trizol试剂提取总RNA，对抽提的总RNA进行检测。总RNA经ND-1000 Nanodrop分光光度计定量，再由Agilent2200 TapeStation系统进行质检，检测其RNA完整性，经质检合格的样品可进行后续的芯片实验。

1.5.2 文库建立和高通量测序 文库构建与质检：通过质检的样品，以1 μg TotalRNA/≥50 ng small RNA起始量进行文库构建，主要步骤为：①3′adaptor连接；②5′adaptor连接；③cDNA合成；④PCR扩增；⑤片段大小选择，使用Agilent2200 TapeStation进行文库质检；通过质检的文库，采用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。

1.5.3 差异表达miRNA筛选 首先进行归一化处理基因表达的数据。归一化的数据转化为Fold Change(FC)值，表示差异表达基因的倍数变化，正负值表示相应基因表达上调或下调。通过差异倍数(|log2(FoldChange)|>1)和显著水平(P<0.05)筛选出组间差异miRNA。

1.5.4 miRNA靶基因预测与KEGG分析和GO分析 通过TargetScan、miRDB、miRTarBase及miRWalk 4款软件预测差异miRNA的靶基因。对4个软件的预测结果进行进一步筛选整理，并以多个软件共同预测结果作为miRNA的候选靶基因。对于预测得到的靶基因，同时进行基因本体(Gene Ontology，GO)的功能富集分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG)的Pathway富集分析,以P<0.05为显著富集。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠睾丸形态学观察

青年对照组生精小管组织结构正常，各层次细胞排列紧密，各期生精细胞可清楚辨认，小而圆的精原细胞离生精小管基膜较近，初级精母细胞、精子细胞及精子有序分布于管腔。老年对照组睾丸中生精小管细胞层次少且排列紊乱疏松，并伴随不同程度的细胞缺失和破裂，腔内出现空隙，生精小管边缘不完整、形态不规则，间质细胞出现空泡样老化改变。艾灸组生精小管组织结构较清晰，管内细胞层次与数量相对自然衰老组明显增加，各层次细胞排列基本整齐。提示艾灸足三里穴可改善自然衰老大鼠睾丸组织形态学。见图1。

2.2 miRNA芯片检测结果

2.2.1 差异表达基因筛选 根据miRNA在睾丸中的平均信号，以(|log2(FoldChange)|>1且P<0.05)为标准，筛选出上调及下调miRNA。其中与青年组对比，衰老组样本筛选出67个具有明显差异表达的miRNA，其中上调miRNA共有3个，下调miRNA共有64个。与干预后的艾灸组相比，老年对照组样本筛选出上调miRNA共有4个，下调miRNA共有35个。根据差异miRNA的P值和差异倍数(Fold change)联合分布情况，得出青年对照组与老年对照组、艾灸组与老年对照组睾丸组织差异表达miRNA火山图。见图2。

2.2.2 艾灸对衰老大鼠睾丸组织miRNA表达谱的影响 艾灸组与老年对照组之间差异的miRNA共39种(P<0.05)。在这39种miRNA中，有28种miRNA与衰老相关(即该miRNA在青年对照组、老年对照组差异亦具有统计学意义)。见表1。从中亦可看出，衰老大鼠在艾灸足三里穴干预后，改善了这28个miRNA在衰老大鼠睾丸组织中的异常表达水平。见表1。

表1 艾灸组主要差异表达的miRNA

续表

2.3 差异miRNA生物信息学分析

2.3.1 GO分析 对艾灸调节自然衰老睾丸组织miRNAs的预测靶基因进行GO分析的结果显示,参与分子功能的基因有7 861个,主要涉及蛋白结合、催化活性和转移酶活性等;参与细胞组成的基因有18 133个,主要涉及细胞器、细胞质等;参与生物过程的基因有16 323个,主要涉及有机物质代谢、初级代谢过程和生物调节等。见图3。

2.3.2 KEGG通路的富集 对艾灸逆转自然衰老睾丸组织miRNAs靶基因进行KEGG显著富集通路分析的结果显示,主要涉及的通路有30个,主要分为4大类,分别为环境信息处理、人类疾病、代谢和有机体系统。涉及的主要通路有FcγR介导的吞噬作用、白细胞经内皮迁移、调节干细胞多能性信号通路、黏着斑、cGMP-PKG信号通路、Hippo信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导、TGF-β信号通路、mTOR信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路及Wnt信号通路等。见图4。

3 讨论

衰老所涉及的方面广阔、机制复杂，对衰老的调控研究一直以来受到生命科学领域的广泛关注。作为男性生殖系统的重要器官，睾丸具有分泌雄激素和产生精子两种功能。生理性睾丸衰老是指睾丸结构和(或)功能增龄性衰退的过程[6-7]。艾灸作为中医的传统疗法，对延缓衰老、调节机体功能起着重要作用。本课题组成员以往开展了有关针灸延缓衰老的临床实践研究，结果显示艾灸可显著改善老年人衰老相关症状[8-10]，并从衰老相关基因、衰老信号传导通路调节和表观遗传修饰等方面研究艾灸延缓衰老的调控机制[11-16]，艾灸对自然衰老大鼠睾丸功能调节也得到初步的验证[17]。但是，睾丸衰老相关调控机制复杂而精密，艾灸干预对睾丸衰老的作用机制需要更进一步的研究与探索。因此，本课题组从miRNA角度观察自然衰老大鼠miRNA表达谱的变化及艾灸的调节作用，探讨艾灸延缓睾丸衰老的作用机制。结果发现，艾灸直接调控自然衰老大鼠睾丸组织28个miRNA的异常表达，其中的一些miRNA被早期研究发现对睾丸功能及其增龄性退化的调控起到重要作用。例如miR-18、miR-19a属于miR-17-92簇，研究显示，miR-17-92簇在衰老机体中下调[18]。另有研究[19]显示miR-17-92簇的缺失突变促使睾丸生精功能受损，其机理可能与miR-17-92KO睾丸mTOR信号的异常激活增加有关。同样维持生精功能的还有miRNA-202，其通过抑制细胞周期调节因子和RNA结合蛋白来维持精原干细胞[20]。最近研究[21]表明衰老睾丸生精功能减退的重要原因就是血睾屏障BTB的完整性被破坏。miR-471为雄激素反应性miRNA，其缺乏降低了睾丸支持细胞血睾屏障BTB功能[22]。Mir-509-5p在睾丸中高表达,其下调与男性不育有关。此外，miR-509-5p对体外培养的生殖细胞瘤(TGCT)细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用[23]。在衰老的机体中发现miR-1的上调[24]和miR-9的下调[25]，这一表达趋势与本研究中的表达结果一致，而艾灸逆转了miR-1、miR-9在衰老大鼠睾丸中的异常表达。氧化性应激是引起衰老和老年疾病的重要因素，与睾丸衰老的发生、发展密切相关。已有研究表明，氧自由基失调引起的慢性氧化应激损伤是导致衰老睾丸睾酮合成功能下降的重要因素[26-27]。目前，大量研究表明，提高机体抗氧化自由基水平是艾灸延缓睾丸衰老的主要机制之一[28]。MiR-190靶向抑制MAPK8的表达来抑制细胞的氧化应激损伤，并降低细胞凋亡水平[29]。研究表明ROS激活COX-2的生成，而COX-2可以抑制胆固醇转运蛋白StAR的表达，从而抑制睾酮的合成[30]。MiR-101b能靶向调控抑制COX-2的表达[31]。本课题组以往研究发现，艾灸能减少自然衰老大鼠睾丸生殖细胞的凋亡和提高睾酮合成水平，结合本实验结果，推测其部分机制可能是由于艾灸纠正自然衰老大鼠上述miRNAs的异常表达，提高抗氧化水平、减少细胞的凋亡和延缓睾丸功能的增龄性退化有关。但这些miRNA在衰老睾丸中的表达情况以及是如何发挥作用的还缺乏深入的研究。

这些miRNA靶基因通过生物信息学的分析，涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫及代谢等多个生物学过程，主要富集于多个信号通路上，如TGF-β、mTOR、MAPK、FoxO及Wnt等信号通路。表明艾灸可以通过多种途径来调控睾丸组织衰老进程。这些通路在睾丸中参与了雄激素合成和精子发生功能的调节。在Leydig细胞中甾体合成酶基因的表达主要受LH调控，LH激活了 cAMP/PKA信号通路。LH与其g蛋白偶联膜受体(LHCGR)结合，引发腺苷酸环化酶的激活，从而将ATP转化为cAMP并活化PKA。PKA的底物包括胆固醇转运蛋白StAR以及对类固醇基因表达至关重要的转录因子[32]。除了cAMP/PKA通路，MAPK信号通路也被证明影响睾丸间质细胞类固醇的生成。例如，表皮生长因子受体(EGFR)的激活通过调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及其下游的细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)参与激素生成的调节[33-34]。综上所述，艾灸可能通过调节衰老睾丸组织中一些miRNAs的异常表达，影响其靶基因的转录，继而调控下游相关信号通路，多靶点、多途径和多环节改善老年大鼠睾丸功能退化，起到延缓生殖衰老的作用。但受限于差异miRNAs和其靶基因数量众多，且miRNA与mRNA存在一对多、多对一和多对多的靶向关系，从miRNA角度探讨艾灸延缓睾丸衰老的调节网络机制具有一定的复杂性。这些miRNA与衰老相关的靶基因在衰老睾丸中的表达情况和艾灸在其中的作用机制仍需深入地研究。