HPLC-DPPH在线联用技术评价制首乌的抗氧化活性

钱金珠，梁 明，余 意，邓亚雷，刘史佳，庞会明，戚 进*

（1中国药科大学中药学院，南京 211198；2无限极(中国)有限公司，广州 510405；3江苏省中医院药学部，南京 210029）

何首乌（Polygonum multiflorumThunb）为蓼科植物何首乌的块根，始载于《开宝本草》，为我国传统的知名中药［1-2］。制首乌为何首乌生品的炮制加工品，现代炮制方法主要包括黑豆蒸制法、黑豆黄酒蒸制法和高压清炖法。制首乌善补肝肾、益精血，临床多取其滋补功能入药［3-5］。现代研究表明，何首乌具有抗氧化、抗衰老、降血脂、调节免疫等药理作用。抗氧化是何首乌主要的药理作用之一，也是其具有抗衰老等其他药理作用的可能原因。目前对于何首乌的抗氧化活性和化学成分已有大量的研究报道，其中酚酸类、二苯乙烯苷类和蒽醌类等类型的化学成分被认为是何首乌中的主要抗氧化成分类型［6-9］，但是对于不同类型化合物中各有哪些具体成分与何首乌特别是制首乌的抗氧化活性相关联，目前尚未见报道。

对于抗氧化活性物质的测定方法主要有传统模式和在线模式两种。传统模式抗氧化活性测定方法如：清除羟自由基法（·OH）、超氧阴离子法（O2•-）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法（DPPH）法、H2O2法、Fe3+还原（FRAP）法等，通常用于中药提取物中一组成分的总抗氧化能力的测定，对于单一成分的抗氧化活性测定，则往往需要大量的分离纯化过程［10-11］。在线模式抗氧化活性测定方法如HPLC-DPPH、高效液相色谱-［2，2-联氨-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐］（HPLC-ABTS+•）、高效液相色谱-化学发光分析法（HPLC-CL）等，具有自动化、稳定化、快速化、规范化等优点，可以同时分析和评价中药中单一成分的抗氧化活性及其对中药总活性的贡献，而减少大量的分离纯化步骤［11-13］，已逐步在中药抗氧化活性研究中得到应用。此前本课题组曾报道采用HPLC-CL 分析方法对14 批不同产地的何首乌的抗氧化活性进行综合评判，并确定了何首乌中主要抗氧化活性成分，但未涉及不同炮制方法的制首乌的抗氧化活性研究［14］。

课题组前期采用传统模式的抗氧化活性测定方法对制首乌不同部位的抗氧化活性进行了初步研究，发现制首乌醇部位具有较强的清除DPPH 作用。因此，本研究建立HPLC-DPPH 在线分析方法，对16 批不同炮制方法的制首乌进行抗氧化活性测定，通过对各批次制首乌的抗氧化总活性以活性加和的方式进行量化，实现对制首乌抗氧化活性的综合评价。并明确制首乌中的主要抗氧化活性物质，对不同炮制方法的制首乌的抗氧化活性进行比较。

1 材 料

1.1 样品与试剂

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，美国Sigma公司）；二苯乙烯苷（南京春秋生物有限公司，纯度≥99%）；甲醇（色谱纯，南京化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Tedia 试剂公司），其余试剂均为市售分析纯。16 批不同炮制方法的制首乌样品信息见表1。

Table 1 Sample information of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

1.2 仪 器

LC-2010CHT 高效液相色谱仪，配置四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、UV 检测器及色谱工作站（日本岛津公司）；十万分之一天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；P230Ⅱ高压恒流泵（大连依利特分析仪器有限公司）；pHS-25 型酸度计（上海雷磁仪器厂）。

2 方 法

2.1 DPPH溶液的制备

精密称取DPPH 适量，溶解于甲醇中，将溶液转移至500 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得到浓度为1×10-3mol/L的DPPH母液，4 ℃避光存放，备用。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取二苯乙烯苷对照品适量，50%乙醇溶解，配制成不同浓度的二苯乙烯苷溶液。

2.3 供试药材的制备

将制首乌人工粉碎至约1 cm 块状，去离子水提取两次，料液比为1∶10，合并提取液，减压浓缩，浓缩液加无水乙醇除去多糖，将上清液浓缩，用D101 型大孔树脂富集，依次用水和乙醇洗脱。收集醇部位，挥干溶剂，即得制首乌大孔树脂醇部位。将16份不同炮制方法的制首乌按照上述方法制备醇部位供试品进行后续研究。

2.4 HPLC-DPPH分析方法

按照图1 的方式将UV 与PDA 连接，色谱柱为Agela Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），基于相关文献报道［14］，结合本课题组前期对不同波长下色谱峰出峰情况的考察，选择LC-10AD 检测器波长为254 nm，二极管阵列检测器PDA 检测波长为517 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量15 μL，流动相为0.1%磷酸水（A）和乙腈（B），洗脱程序如下：0 ~ 6 min，6% ~ 6% B；6 ~ 10 min，6% ~10% B；10 ~ 15 min，10% ~ 10% B；15 ~ 25 min，10% ~ 15% B；25 ~ 45 min，15% ~ 20% B；45 ~ 70 min，20%~30%B；70~75 min，30%~35%B；75~85 min，35% ~ 60% B；85 ~ 90 min，60% ~ 65% B；90 ~ 100 min，65% ~ 65% B；100 ~ 105 min，65% ~100%B；105~110 min，100%~100%B。

Figure 1 HPLC-DPPH on-line analyzer system

外接设备条件：P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入DPPH 流速0.4 mL/min，浓度1 × 10-4mol/L。PEEK管长度6 m，内径0.1 mm。

2.5 HPLC-Q-TOF-MS条件

Agilent 1260-6530 HPLC-Q-TOF，负离子模式扫描。流动相中将0.1%磷酸替换成0.1%甲酸。离子源参数：干燥气（N2）温度：350 ℃，流速，9.0 L/min；毛细管电压，3 300 V；雾化压力，40 psi（1 psi=6.895 kPa）；质量扫描范围m/z：100~1 000。

数据采集采用HPLC-Q-TOF-MS MassHunter Acquisition Software Version B.04.00 软件，数据处理采用MassHunter Workstation Qualitative Analysis软件Version B.06.00 软件完成。其中元素组成测定参数设定如下：C，0~50；H，0~100；O，0~50；N，0~3；初步假定所有化合物均不含有磷，硫，溴和氯等元素；最大允许误差范围为±5×10-6。

3 结果与讨论

3.1 HPLC-DPPH在线分析条件考察

前期实验表明，DPPH 流速与浓度对系统检测灵敏度影响较大，因此以S01 批次（201506001）制首乌作为研究对象，以总倒峰峰面积为考察指标，对实验条件进行优化，分别考察P230Ⅱ外接高压恒流泵泵入DPPH 流速（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min），以及泵入DPPH 浓度（1 × 10-5、2×10-5、3.5×10-5、5×10-5、1×10-4mol/L），如图2-A、2-B所示，在DPPH 泵入流速为0.4 mL/min，浓度为1×10-4mol/L时检测效果最好。

PEEK管的长度可直接影响样品与DPPH的反应时间，管长越长，反应越完全，系统压力也越大，因此以系统能承受最大压力为考察限度，选择PEEK管的长度为6 m进行后续实验（图2-C）。

此外，PEEK 管的内径可影响活性峰的展宽，对PEEK 管内径（0.1 mm、0.5 mm）进行考察，结果表明，PEEK 管内径为0.1 mm 时，峰宽为1.007；内径为0.5 mm 时，峰宽为4.235。因此，选择内径为0.1 mm PEEK管用于后续实验。

Figure 2 Effect of different flow rate(A),different concentration of DPPH(B)and different lengths of PEEK tube on(C)sample determination

3.2 不同批次制首乌醇部位抗氧化活性指纹图谱的建立及共有峰标识

Figure 3 HPLC chemical chromatogram with activity chromatogram of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

通过HPLC-DPPH 在线联用系统得到不同批次制首乌样品中的化学指纹图谱和对应的抗氧化活性指纹图谱，对其进行综合分析，标识出具有抗氧化活性作用的共有峰共12 个（图3）。通过HPLC-Q-TOF-MS 对11 个抗氧化活性物质进行鉴定，其中，儿茶素（catechin，峰2），2，3，5，4′-tetrahy‑droxystilbene-2-O-di-glucoside（峰3），trans-2，3，5，4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside（反-2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，峰5），2，3，5，4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-（galloyl）-β-D-glucoside（2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-（没食子酰）-β-D-葡萄糖苷，峰6、8、11），峰12对DPPH 产生了显著的清除作用。从质谱数据可知，制首乌抗氧化成分为酚酸类和二苯乙烯苷类化合物，与文献报道结果一致［16-18］。

3.3 制首乌中抗氧化物质的活性评价

不同批次不同炮制方法的制首乌，其抗氧化活性能力各不相同，且活性无法简单加和，需建立一个可加和的活性指标对其整体抗氧化活性进行评价。本研究以二苯乙烯苷作为阳性参比，首先建立二苯乙烯苷清除DPPH 的峰效数学模型，x为二苯乙烯苷的量（单位：mg/mL），y为活性峰面积，建立二苯乙烯苷清除DPPH 的峰（y）与效（x）之间的函数关系：y= 280 226.05x -9 523.83x2+123.44x3+ 25 866.5（R2= 0.999 22），峰效关系方程曲线见图4，根据峰效函数关系方程计算16批制首乌抗氧化活性，以1 mg/mL 二苯乙烯苷为一个活性单位（1 U）［19］，对16批样品中各峰的抗氧化相对活性及其总活性进行测定，每个化学峰的峰面积对总峰面积的贡献率（图5-A）及各共有峰相对活性对总抗氧化活性的贡献率（图5-B）。图5-A 中Peak 5、6 在大多数样品中都显示较高的峰面积贡献度，其相对活性贡献在图5-B 显示也很高。相反Peak 2 和Peak 8 在图5-A 并未表现出较高的峰面积贡献度，但在图5-B 中依然有较高的活性贡献度；图5-A 中峰面积贡献度较高的Peak 9、10 在图5-B 中并没有出现相应的活性贡献度。根据HPLC-MS 鉴定，活性较好的化合物多为二苯乙烯苷类，而Peak 9、10为polygonumosides A 类化合物，为二苯乙烯苷类衍生物，虽然在何首乌中具有较高的含量，但是其并未表现出较高的抗氧化活性。因此化合物的相对活性并不与峰面积成正相关，在抗氧化活性评价中，不适宜以化学指纹图谱的峰面积作为评价指标，应结合活性指纹图谱共同评价为宜。

Figure 4 Peak-effect function relationship equation of standard peak area and antioxidant capacity

通过已建立的加和方法，对16 批制首乌具有抗氧化活性的12个共有峰总抗氧化活性进行加和分析，可以更直观地得到不同批次制首乌的抗氧化活性强弱（图6-A）。以上分析剔除了活性较弱的活性峰，为了验证该方法是否能准确评价制首乌的抗氧化活性，对每批次制首乌总活性进行加和分析，得到16 批制首乌所有活性峰总抗氧化活性（图6-B）。通过比较分析，活性较强的共有峰总抗氧化活性结果与所有活性峰总抗氧化活性结果一致，证明该方法能够反映制首乌的总体抗氧化活性，且批次S01（黑豆）、S02（黑豆）、S03（黑豆）、S09（高压）、S11（黑豆黄酒）、S15（黑豆黄酒）表现出较高的抗氧化活性，表明不同炮制方法均具有一定的抗氧化活性，但其结果可能与本研究所选取的高压炮制的制首乌批次较少有关。此方法的建立在一定程度上能够更好地评价制首乌的质量，也为制首乌的质量评价标准提供了新的依据。

Figure 6 Total antioxidant activity contributions of Polygoni Multiflori Radix Praeparata samples(A)and total antioxidant activity of all active peaks in Polygoni Multiflori Radix Praeparata samples(B)

4 结 论

现代研究表明，氧化应激可诱发多种疾病的发生，如动脉硬化、肿瘤、糖尿病、高血压和代谢综合征等疾病。制首乌具有调节造血功能、延缓衰老、改善中枢神经退行性疾病等药理作用。如二苯乙烯苷能改善小鼠记忆力，增加SOD 酶活性，减少血清活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）等水平，上调小鼠各脏器组织相关蛋白表达，延缓衰老［20］；作为的滋补中药，制首乌在抗氧化、增强免疫力、抗衰老等多方面作用显著［21］。因此对其抗氧化活性及质量控制研究具有重要意义。

本研究建立了从复杂化学成分中快速遴选抗氧化活性成分的HPLC-DPPH 在线联用分析方法，并对16 批3 种炮制方法的制首乌进行抗氧化活性测定，结合化学指纹图谱和活性指纹图谱，筛选出12 个共有抗氧化活性成分，通过HPLC-Q-TOF-MS鉴别出其中11个成分，其中多为二苯乙烯苷类、酚酸类成分。并以二苯乙烯苷为阳性对照，建立峰效关系模型，对各成分及各批次制首乌抗氧化活性进行评价。3 种炮制方法的16 批制首乌均具有一定的抗氧化活性，表明不同炮制方法对制首乌的品质无明显影响，但也可能与选取的高压炮制的制首乌批次较少有关。所建方法能够体现不同批次制首乌之间抗氧化活性的差异，其中批次S01、S02、S03、S09、S11和S15表现出较高的抗氧化活性。

本研究建立的HPLC-DPPH 在线联用方法相较于传统模式抗氧化活性测定方法具有操作简便、耗时短等优势，在得到化学指纹峰的同时可得到活性指纹峰，在快速测定制首乌中主要抗氧化活性成分的同时分析其抗氧化能力，该方法进一步结合HPLC-Q-TOF-MS 技术进行鉴别，能够提供活性指纹峰的结构信息，以实现“成分－峰－效”的综合分析。上述研究为遴选制首乌中的抗氧化活性成分提供了一种高效、便利的方法，也为其他中药及其炮制品的抗氧化活性成分遴选提供了参考。