固定化木瓜蛋白酶的应用进展

黄秋岚 田程飘 唐桓伟 单彬 庞新华

摘 要：木瓜蛋白酶是来自于热带、亚热带水果番木瓜的蛋白酶，经固定化后可以增强其功能特性，有利于进一步开发与利用。固定化木瓜蛋白酶应用范围广泛，在多个领域中均有应用，但是同时也存在着研究水平较低、应用程度较浅的问题，因此还可以做更深入、全面的开发，将其优秀的酶学性质发挥到各个行业中。本文简述了木瓜蛋白酶的固定化方法及固定化木瓜蛋白酶在食品、医药等行业的应用，以期为木瓜蛋白酶今后的研究与利用提供参考。

关键词：番木瓜;木瓜蛋白酶;固定化

中图分类号：S668.2                        文献标志码：A

Application Progress of Immobilized Papain

HUANG Qiulan，TIAN Chengpiao，TANG Huanwei，SHAN Bin*，PANG Xinhua

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute/ Key Laboratory for Quality and Safety Control of Subtropical Fruit and Vegetable，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanning，Guangxi 530001，China）

Abstract：Papain is a kind of proteases derived from tropical and subtropical fruit papaya. After being immobilized，papain’s functional properties could be enhanced，and is conducive to further development and application. Immobilized papain has a wide range of applications in many fields. But there are problems of low levels of research and application. Therefore，more in-depth and comprehensive development should be done，and the application of enzymatic characteristics would play a role in various industries. This article briefly reviews the immobilization method of papain and the application of immobilized papain in food，medicine and other industries，providing reference for the future research and utilization of papain.

Key  words：Carica Papaya;Papain;immobilization

番木瓜（Carica papaya）又名木瓜、萬寿果、乳果，是番木瓜科番木瓜属的多年生小乔木，在我国南方地区具有很大的栽培面积[1]。据广西壮族自治区亚热带作物研究所番木瓜创新团队统计，广西地区的番木瓜的种植面积约4000 hm2，占全国种植面积的60%左右。木瓜蛋白酶（EC：3.4.22.2）是来源于热带水果番木瓜的一类含巯基的蛋白水解酶，在番木瓜果树的根、茎和叶中都广泛存在[2]，在未成熟果实的新鲜乳汁中尤为丰富[3]。木瓜蛋白酶是由212个氨基酸组成的单肽链内切酶，其中第25位的半胱氨酸残基和第158位的组氨酸残基位于其活性中心[4]。木瓜蛋白酶具有较高的热稳定性、pH适用范围广、底物专一性低等特点，是一种常见的生物催化剂，可用于肉类嫩化、蚕丝脱胶及提高饲料品质等。我国的木瓜蛋白酶产业处于起步阶段，而市场的需求量较大，因此其具有很大的发展空间和强劲的发展势头，值得深入研究。

由于酶的蛋白质特性，使得酶在催化反应过程中往往短时间、单次使用后就丧失活性，失去催化能力，无法进行重复利用。采取适当方法将酶固定至特定的载体，可以增强酶稳定性、延长贮藏期、易于分离回收、提高利用率和缩短反应时间，有利于降低生产成本，通过固定化，木瓜蛋白酶的酶学特性也可以获得显著的提升。本文对固定化木瓜蛋白酶在不同行业中的应用进行综述，以期为固定化木瓜蛋白酶的开发与应用提供一定的借鉴。

1 木瓜蛋白酶的固定化方法简介

各方面研究者经过多年的探索与实践，总结出不少有效的酶固定化方法，包括传统的包埋法、吸附法、交联法和结合法以及新型的膜固定化[5]、微波辅助固定化[6]、无载体固定化[7]等。其中常用于木瓜蛋白酶的固定化方法有吸附法、包埋法、载体交联法等[8]。李琳[9]利用改性后的竹材料作为载体，经吸附及共价结合两种方法共同作用，对木瓜蛋白酶进行固定，获得的固定化木瓜蛋白酶具有操作稳定性提高，耐贮存、耐碱及耐高温等特点。Baidamshina等[10]将木瓜蛋白酶固定至中等分子量（200 kDa）和高分子量（350 kDa）壳聚糖基质上，得到的固定化木瓜蛋白酶表现出更高的热稳定性和更长的半衰期。韦美苹等[11]采用金属螯合的方式将木瓜蛋白酶固定于磁性粒子，固定后的木瓜蛋白酶可以有效地降解黑蚂蚁蛋白。对比游离酶，固定化后的酶具有易再生，再生后酶活稳定等优点。这些研究结果均表明固定化后的木瓜蛋白酶的热稳定性、耐碱性等酶学性质可以得到进一步的优化和提高，这一特性有利于其在各个领域中更好地发挥作用。

2 固定化木瓜蛋白酶的应用

2.1 固定化木瓜蛋白酶在食品行业的应用

牛蒡是我国传统的药食同源植物，营养价值高，其中的牛蒡多糖具有抗氧化性、抗凝血性、降血糖等多种生物活性，具有很高的食用和保健价值。以壳聚糖为载体，在合适的工艺条件下对木瓜蛋白酶进行处理，可以得到固定化木瓜蛋白酶。利用此固定化木瓜蛋白酶提取牛蒡多糖（提取参数：pH 6.5，时间8 h，料液比1：20，加酶量1.8 g/g），最终获得11.04%的提取率，并且固定化酶在重复使用5次后仍保留50%以上的酶活力。该研究为牛蒡多糖的提取摸索出一个行之有效的方法，也为其它药食同源植物说的生物活性成分提取提供了一个借鉴[12]。

果汁、啤酒等饮料在低温与长期放置的过程中，会出现冷浑浊（Chill haze）现象，影响产品的品质。早在20世纪90年代，我国就有学者利用固定化酶对饮料的冷浑浊问题进行研究。徐凤彩等[13]将处理后的尼龙固定木瓜蛋白酶用来处理啤酒。经固定化木瓜蛋白酶处理后的啤酒浑浊度下降了2～11倍，蛋白质含量比未处理的啤酒下降了55%，同时啤酒还能保持原有风味，延长低温保藏时间，冷浑浊现象得到明显改善。除了利用尼龙作为载体外，还可以用壳聚糖固定化木瓜蛋白酶对啤酒进行处理。姜涌明等[14]利用壳聚糖作为载体，以戊二醛作为交联剂，得到的固定化木瓜蛋白酶对啤酒进行澄清实验。实验结果表明，经最佳条件下制备所得壳聚糖固定化木瓜蛋白酶处理后的啤酒，蛋白质浓度从56.5 mg/L降至2.7 mg/L，澄清效果显著，有利于提高啤酒的质量及商业价值。

壳聚糖固定化的木瓜蛋白酶同样也能应用在果汁澄清中。Yava<E：＼H盘的＼2017年广西热作＼2022年＼第1期＼28.jpg>er[15]利用N，N-亚甲基双丙烯酰胺交联甲基丙烯酸2-羟乙酯和戊二醛交联的冷冻凝胶化壳聚糖对木瓜蛋白酶进行固定化，并将固定化木瓜蛋白酶用于苹果果汁澄清处理。在pH 值4.08反应条件下对苹果汁进行澄清，固定化木瓜蛋白酶的澄清率达到了31.4%的水平，而游离的木瓜蛋白酶的澄清率仅为14.7%，远低于固定化酶，与仅用冷冻凝胶化壳聚糖的澄清率（12.5%）接近。Leila等[16]利用磁性纳米颗粒对木瓜蛋白酶进行固定化研究，使用游离的木瓜蛋白酶与固定化木瓜蛋白酶对石榴汁进行实验。在50 ℃下，游离木瓜蛋白酶与固定化木瓜蛋白酶在第14 d时石榴汁的浑浊度为44.2、44.7，显著低于未作处理的石榴汁浑浊度（92.7）。其中固定化木瓜蛋白酶在重复使用10次后仍保留40%左右的酶活力，在保存20 d后仍保留了接近80%的酶活力，远高于游离的木瓜蛋白酶。在食品安全问题日益受到重视的环境下，来源于水果的木瓜蛋白酶非常契合食品行业的安全需求，这一特点有利于其在食品行业中广泛使用。木瓜蛋白酶经过固定化后，随着耐热性、耐碱性、可再生等优点的显现与放大，获得了更多的青睐，这有利于进一步拓宽木瓜蛋白酶在食品行业中的应用范围。

2.2 固定化木瓜蛋白酶在医药行业的应用

固定化木瓜蛋白酶在医药领域的应用也取得了值得关注的进展。猫爪草是毛茛科植物小毛茛的干燥块根，是一种常见的中药材，其多糖具有丰富的生物活性，例如抗炎症、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等[17-19]，具有较高的医疗保健价值。廖启元等[20]采用固定化木瓜蛋白酶，在固定化酶用量12%、酶解温度60 ℃、酶解时间2 h、pH值6.0的最佳工艺下脱除猫爪草粗多糖当中的蛋白质，最终获得的多糖保留率为73.2%，蛋白脱除率为71.3%，有效地降低了蛋白质对猫爪草多糖作用的干扰，该研究也为今后的中草药有效活性成分的提取纯化提供了一个可参考的方法。

固定化木瓜蛋白酶对创伤处理有一定的作用[21]。Vasconcelos等[22]将木瓜蛋白酶固定至过氧化细菌纤维素（ OxBC ）膜上，经OxBC膜固定的木瓜蛋白酶在模拟发炎的皮肤上可以延长此膜的作用时间，该特性可以提高OxBC膜在去除慢性皮肤伤口中的化脓和坏死组织的作用效果，为未来的医疗用生物敷料提供了一种新的可能。

抗原结合片段（Antigen-binding fragment， Fab）可以作为抗体药物对某些特定疾病进行治疗，目前已有多种Fab类抗体药物通过了美国食品药品监督管理局（FDA）批准[23]。Armutcu等[24]利用冷冻凝胶固定化木瓜蛋白酶生物反应器对人免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）抗体进行消化处理，并对消化产物做定性研究。实验结果显示IgG的消化率达到80.6%，其中Fab片段的比例为37.84%，是消化产物中含量最高的片段。此研究说明固定化木瓜蛋白酶通过消化免疫球蛋白可以有效地获得具有治疗作用的Fab片段。除了上述研究外，还有大量报道指出固定化木瓜蛋白酶在临床治疗上取得了显著的成果，这对木瓜蛋白酶在医药行业的深入研究具有重要意义。

生物医药因具有资源足、跨学科、成本低等特点获得了迅速的发展，是当前科研热点之一。木瓜蛋白酶作为一种植物来源的天然产物目前在该行业已经表现出了一定的利用价值，经固定化后其性能获得提升，这有利于进一步挖掘它更多的功能与利用途径，以期在生物制药、临床医疗上取得更多有突破性的成果。

2.3 固定化木瓜蛋白酶在其它行业的应用

2.3.1 生物肽制备

生物活性肽一般指由氨基酸经过不同组成和排列构成的，分子量小于6000 D的多肽，具有较高的生物活性及生物相容性[25-28]，同时还具有抗菌、抗疲劳、免疫调节[29]等功能，在日常保健及临床研究中都发挥着重要作用。大豆肽是大豆蛋白水解产生的短肽，具有降血压、降胆固醇和抗氧化等生理功能[30]。曹玉华等[31]以壳聚糖作为载体，利用戊二醛交联把木瓜蛋白酶进行固定化，在55 ℃、pH 7.8、底物浓度2.0～3.0 mg/mL和0.2 mL/min的水解条件下成功地制备出大豆肽，最终获得的产物水解度为42.6%，酶解液中大豆肽的含量为1.453 mg/mL。抗氧化肽具有抑制活性氧的形成、清除自由基和分解过氧化物等活性的功能[32]，是一种天然的抗氧化剂，具有较高的安全性。杨久兴[33]利用自制介孔材料L-MCM-41作为载体用以固定木瓜蛋白酶，对扇贝蛋白进行水解制备抗氧化扇贝肽。实验结果显示，固定化酶水解后獲得的扇贝肽具有很高的抗氧化活性，高于非固定化酶。利用固定化酶水解所得到的扇贝肽还原力最大值约为游离酶所制扇贝肽的2倍，并大大缩短了酶解时间。刁文锦等[34]利用超大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯作为载体对木瓜蛋白酶进行固定化，用于催化酵母蛋白制作酵母抗氧化肽。在固定化木瓜蛋白酶的催化下，得到的水解产物最高的抗氧化活力为81.2 mol TE/g，远高于蔬菜和水果的抗氧化活力。此外，在重复使用了20次后，固定化木瓜蛋白酶仍保留着35%的初始酶活力。

2.3.2 纺织行业

木瓜蛋白酶可用于蚕丝脱胶、皮革软化、羊毛防皱[35-36]等纺织工艺，经固定化后其优点可以进一步放大。Xue等[37]利用1，2，4-苯三甲酸酐和均苯四酸对木瓜蛋白酶进行化学修饰后固定至活化棉织物，得到的固定化修饰酶的热稳定性、耐碱、耐洗涤性均有明显提高。当去污剂浓度为20 mg/ml时，固定化的均苯四甲酸木瓜蛋白酶的活性仍保持其原始活性的40%左右，而天然木瓜蛋白酶几乎被抑制。此工作证明了棉织物固定化改性木瓜蛋白酶在功能性纺织品领域具有潜在的应用价值。

2.3.3 化工行业

在洗涤剂中加入酶或酶制剂也能起到催化作用。酶将某些有机污垢分解为小分子后，可以提高污垢的水溶性从而去除污垢，蛋白酶则是最早在洗涤剂中应用的酶[38]。Sangeetha等[39]将经过邻苯二甲酸改性处理后的木瓜蛋白酶固定至玉米淀粉凝胶上，得到的固定率为98%，远高于高岭土等其它载体。经固定后的改性木瓜蛋白酶保留的酶活力为78%左右，同时其热稳定性、最适pH值均有提高。当添加至洗衣粉中时，对比游离的木瓜蛋白酶，固定化酶具有更高的酶活力。此实验结果表明了固定化后的改性木瓜蛋白酶在家用洗衣粉上应用潜力。随着人们环保意识的提高，对化工行业的要求也随之提高。木瓜蛋白酶是植物来源酶，不会造成环境污染，是环境友好型催化剂，经固定化后可重复利用更减少了废弃物的排放，这与绿色发展理念相契合，同时也有利于其在化工行业的开发与应用。

3 展望

我国番木瓜种植面积广泛，木瓜蛋白酶的利用历史长，适用范围广，具有广阔的开发前景。其中固定化木瓜蛋白酶与游离的木瓜蛋白酶相比，具有更广泛的pH适用范围及更高的热稳定性，并且可以重复利用，能有效降低使用成本，提高生产效率和提高番木瓜的市场附加值。

基于以上特点，固定化木瓜蛋白酶在各领域的应用都取得了一定的成绩，但是目前木瓜蛋白酶及其固定化的研究程度较低，实现产业化应用的能力仍比较有限，现阶段的成果难以满足我国迅速发展的工业需求。这也说明在木瓜蛋白酶及其固定化上仍有较大的发展空间与生产价值，因此亟待相关研究人员开发出更多的利用手段，例如固定化方法的创新、酶专用品种的选育、酶的生物合成、酶的分离纯化等，进而能更全面、高效地发挥木瓜蛋白酶的作用，提高番木瓜的附加值，拓宽番木瓜资源利用途径，进一步促进番木瓜产业的增长，加快我国的亚热带特色农业现代化建设步伐。

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作者简介：黄秋岚（1994-），硕士，现主要从事生物技术相关工作。

*通信作者：单彬（1986-），硕士，高级实验师，主要从事热带、亚热带水果种质资源利用研究工作，E-mail：zzbj219@163.com。

收稿日期：2022-01-03