无损检测技术在食品微生物检测中的应用与展望

苗小雨，柴春祥，鲁晓翔

(天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津，300134)

食品安全是关乎公众健康、社会福祉的重大问题，受到人们的高度关注。食品微生物污染是影响食品安全的主要因素。在国家市场监督管理总局发布的全国食品安全抽检检测数据中，微生物污染始终在食品安全问题中占很大比例[1]。因此加强食品中微生物污染的监督与管理，采用恰当、高效的微生物检验方法和检测技术尤为重要。

目前国家食品安全标准中的食品微生物检测方法多为传统微生物培养法。通常需要对食品样品进行预处理，增菌操作，分离培养，生化试验以及血清学鉴定等，最终来实现对微生物的定性和定量检测。这一方法准确度高且应用最为广泛，但过程耗时长、步骤繁琐、对于操作人员熟练度的要求高。

为提高检测效率以及更适应市场和实际应用的条件，食品微生物快速检测技术逐渐发展起来。较为典型的快速检测技术有免疫学检测技术、色谱学检测技术以及分子生物学技术等。这些技术弥补了传统微生物检验技术时间长、操作复杂的缺点，但仍需要对食品样品进行前处理，会对待检测食品造成破坏，无法对大量样品进行检测。一些分子生物学技术如数字PCR等的检测方法成本太高[2]，难以普遍推广使用。无损检测技术是一种可以快速、准确的检测食品中微生物的技术，相较于其他检测技术更加方便快捷，且对检测样品无破坏性和侵入性，可在原位进行无损害检测。

无损检测技术是一种非破坏性的检测技术，是指在不损坏待测食品原本物质状态及内部结构情况下，通过待测样品对热、光、电、声、磁等产生的一些变化来进行检测[3]。无损检测技术在食品的快速检测，筛选分级，品质鉴定以及安全分析等方面已有应用[4-5]。用无损检测技术进行食品微生物检测无需大量试剂，检测所需时间短，结果更准确且对食品无损害。无损检测技术还可以进行在线监测，对将要受到严重污染的食品样品进行预测，具有及时性和预见性，能避免大量资源的浪费。常用于食品微生物检测的无损检测技术有近红外光谱技术、高光谱成像技术、计算机视觉技术以及电子鼻技术和电子舌技术。本文主要对上述5种无损检测技术在食品微生物检测中的应用情况进行总结，阐述其应用情况和存在的问题，展望其应用前景。

1 近红外光谱技术在食品微生物检测中的应用

近红外光谱技术(near infrared spectroscopy，NIR)是一种基于光谱技术对食品进行分析检测的技术，已应用于食品的品种鉴别，品质检测等方面[6]。近红外光的波长范围为780～2 526 nm。近红外光谱是分子振动光谱，样品中的C—H、O—H、N—H和S—H等含氢化学基团对近红外光产生合频和倍频吸收，由于不同基团对近红外光吸收的波长和强度不同，能产生含有丰富结构和物理化学信息的近红外光谱，从而对食品样品进行检测与分析。微生物中的核酸、蛋白质等成分可吸收近红外光产生不同的光谱信息，因此可以建立近红外光谱信息和微生物的结构组成以及微生物数量上的相关性，使得近红外光谱技术可以用于微生物的定性和定量检测[7]。

1.1 食品中菌落总数的检测

1.2 食品中致病菌的检测

大肠杆菌等食源性致病菌通过感染食物会引起细菌性食物中毒危害人体健康。近红外光谱技术可以对食品中常见的致病菌进行定性鉴别。王建明等[13]利用傅里叶变换近红外光谱仪对乳制品中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌进行检测，发现同为革兰氏阴性菌的大肠杆菌和阪崎肠杆菌的光谱区别很小，但结合偏最小二乘判别分析和多元散射校正预处理后对这3种致病菌的判别准确率与近红外透射光谱的一致性达到了100%。食品样品中致病菌的污染程度也会对鉴别效果有所影响。MARTOS等[14]通过检测牛奶中的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的近红外光谱，发现当污染水平高于5 lgCFU/mL时，偏最小二乘判别模型便可区分出牛奶基质中的这两种菌，在高浓度污染下(8～9 lgCFU/mL)分离效果更明显，且以牛奶为生长培养基的样品比在培养基中生长再悬置于牛奶中的样品鉴别效果好。为了更快速准确鉴别食品中的致病菌，刘建学等[15]建立了基于主成分分析改进的贝叶斯判别方法对3种典型食源性致病菌进行近红外光谱检测，结果表明相较于贝叶斯判别和主成分分析，改进的贝叶斯判别方法对未知样品的判别正确率有所提高，可达到100%。以上研究表明近红外光谱技术在食品致病菌定性判别方面已有较多应用。

1.3 食品中霉菌及其毒素的检测

霉菌污染食品后可能会在食品中产生霉菌毒素，对人体健康造成极大的危害，近红外光谱技术可对食品中的霉菌污染情况进行检测。谷物类粮食极易受到霉菌的侵害产生霉变。沈飞等[16]对接种不同霉菌的稻谷进行近红外光谱检测，采用主成分分析和判别分析建立分析模型，结果表明近红外光谱技术可有效区分被多种不同霉菌污染的稻谷，平均判别正确率为87.5%，但不及单一霉菌污染的判别正确率(92.5%)高。ZHANG等[17]采用近红外光谱技术结合多元线性回归算法定量检测稻谷中霉菌菌落总数，建立了稳定的预测模型，校正数据集相关系数为0.943，预测数据集相关系数为0.897，展现了近红外光谱技术对于稻谷贮藏中霉菌污染监控方面的潜力。近红外光谱技术也可对花生中的常见产毒霉菌进行分析检测，刘鹏等[18]的研究结果表明随着花生贮藏时间的延长，近红外光谱技术对花生中霉菌的区分效果越好，采用偏最小二乘回归法建立的霉菌总数的模型有效决定系数为0.847 1、交互验证均方根误差为0.276 lgCFU/g，剩余预测偏差为1.92。对于果蔬中霉菌及其毒素的检测，张亮[19]利用近红外光谱信息能够识别出苹果中的扩展青霉，在多种霉菌共同污染的条件下，近红外光谱法对苹果中扩展青霉的检测限为1.5×103个/mL。并在水溶液、浓缩苹果汁和鲜榨苹果汁3种不同的体系中对展青霉素的含量进行检测，对于展青霉素的检测限在水溶液中为9.29 μg/L，浓缩苹果汁中为9.5 μg/L，鲜榨苹果汁中为9.54 μg/L，均符合国家食品安全限量标准。近红外光谱技术已广泛应用于稻谷、玉米、花生、苹果等食品中霉菌及其毒素的检测，对于食品霉菌的早期预防监测有很大的潜力，但由于近红外光谱技术的点扫描方式，限制了对于霉菌污染不均匀样品的检测。

近红外光谱技术可以高效快速对食品中的微生物进行定量定性检测，还能在微生物发酵过程中监测微生物活菌数量，更好的调控生产过程[20]。但对于一些检出限较低的样品，近红外光谱技术检测精度不高，这是因为痕量的污染量对样品光谱特性产生的影响尚不能被检测到。近红外光谱技术能够快速鉴别食品中的不同微生物，可用于食品微生物菌种的鉴定分类和快速筛选研究，但仍有些局限性，对于某些细胞结构成分相似的细菌区分效果不是很理想。

2 高光谱成像技术在食品微生物检测中的应用

高光谱成像技术(hyperspectral imaging technology，HSI)融合了光谱学和图像学技术的特点，能同时检测到待测食品的光谱信息和图像信息。高光谱的光谱分辨率可达到10-2λ数量级，光谱范围包含200～2 560 nm，甚至大于2 560 nm。高光谱成像系统大致包括光源、分光装置、相机、成像高光谱仪和计算机等。当光源照射样品后产生反射或透射，经过分光装置将混合光分散成不同频率的单色光，用成像高光谱仪可将投射的光转换成光谱图像，在光谱覆盖范围内数十至数百条光谱波段对目标物体连续成像，得到包含样品大量信息的三维光谱图像数据[21]。高光谱成像技术的高分辨率可检测出微生物细胞核中的蛋白质、核酸等成分的振动信息，微生物分子基团对于光谱吸收产生的光谱曲线也提供了丰富的微生物检测信息[22]。

2.1 食品中菌落总数的检测

高光谱成像技术能对食品中的菌落总数进行定量分析，还可检测出食品中细菌的污染分布情况。郑彩英[23]利用高光谱成像技术检测冷却羊肉表面的细菌总数，在900～1 700 nm波长范围内采用径向基函数人工神经网络构建了细菌总数预测模型，相关系数为0.998 8，RMSEP为0.250 7。并利用高光谱图像信息对冷却羊肉的污染区域进行了有效识别。成军虎[24]采用高光谱成像技术对冷藏条件下草鱼的菌落总数变化进行检测，并通过将高光谱图像信息转化成化学图像来实现对草鱼片中细菌分布的可视化分析，能够直观的观察草鱼菌落总数的污染情况。ACHATA等[25]采用高光谱成像技术结合化学计量学方法对密封保存的牛肉背最长肌上细菌生长进行原位无损预测，通过两个光谱区域数据融合和光谱预处理等方法提高了预测模型的性能，得到最佳菌落总数预测模型的R2为0.86，RMSEP为0.89 lgCFU/g，RPD 为2.27，成功对不同贮存温度下牛肉背最长肌中的菌落总数进行了预测。表明了高光谱成像技术对于肉类供应链中微生物监控和快速分析的潜力。高光谱成像技术检测菌落总数时更多应用于肉类、水产品等极易腐败变质的食品中。已广泛用于测定羊肉、牛肉、草鱼等食品的表面微生物污染情况，并可基于菌落总数污染情况对食品品质、安全以及新鲜度进行评定与分析。

2.2 食品中大肠菌群的检测

2.3 食品中霉菌等其他微生物的检测

高光谱成像技术可快速、高效的用于检测食品中的微生物，适用于食品的在线检测。定量测定食品中微生物时，还可观察到微生物在食品样品中的分布情况，更直观的反映了食品中微生物的含量。但在微生物菌种分类鉴别的定性检测中应用较少，且在测定细菌数量时，多为测定食品表面的微生物，无法对食品内部微生物进行深层检测。高光谱成像技术所适用的食品范围多为肉类、水产品、谷物等具有一定空间性、介质复杂不均匀的食品，而对于液体类等食品中的微生物可视化检测较少。高光谱成像技术可在紫外、可见光、近红外和中红外区域等波长范围内对微生物进行测定成像，使得到的结果更全面准确，但其大量的信息使得数据处理时间较长，分析检测速度较慢。目前测定食品中微生物选定波段多为可见光和近红外短波(400～1 700 nm)，得到的预测模型性能更优。

3 计算机视觉技术在食品微生物检测中的应用

计算机视觉技术是指采用计算机、摄像机等设备来模拟人视觉的一种技术，它可以用摄像机和电脑代替人眼和人脑对待测样品进行识别、拍摄和分析。它的基本原理是用摄像机获得待测食品的图像，通过信号转换器将图像信息转换成数字信息，结合模式识别等数据处理方法实现对样品的快速分析检测[30]。计算机视觉技术在食品中已应用于食品尺寸大小、外观形状、色泽、表面缺陷的检测等，还可用于食品干燥过程中的实时在线监控[31]。对于食品中微生物污染的检测，计算机视觉技术可通过对食品表面颜色、状态的分析以及对微生物菌落特征(形态大小、颜色、纹理等不同特性)的检测，来达到对食品微生物的快速识别和定量检测。

3.1 食品中大肠菌群的检测

计算机视觉技术可以基于对菌落颜色变化的检测来实现对大肠菌群的识别和数目的测定。殷涌光等[32]利用大肠杆菌可以发酵乳糖产酸从而在特定指示剂中使溶液变色沉淀的特性，设计了一套基于计算机视觉的大肠杆菌快速定量检测系统，结果表明该方法较传统检测方法相关性高(R2为0.995 5)，不存在显著性差异(t检验，P>0.05)，且检测时间由传统方法的6 d缩短到了18 h。丁筠[33]采用计算机视觉技术结合活菌染色法，建立了能够对食品中的活菌总数和大肠菌群进行快速检测的系统。该快速检测系统的检出限为1 cell/mL，检测范围为1～1×106cells/mL。丁筠等[34]利用计算机视觉检测了蔬菜中的大肠杆菌，采用美兰溶液进行活菌染色，并结合主成分神经网络构建模型，结果表明该模型比普通的BP神经网络模型识别时间短、误差小，对大肠杆菌的识别正确率为91.33%。计算机视觉技术可对食品中的大肠菌群进行快速检测，但目前计算机视觉检测食品中大肠菌群多与活菌染色相结合，染色方法对于不同细菌的检测结果有所影响。

3.2 食品中致病菌的检测

WANG等[35]设计了一种选择性培养基结合计算机视觉的方法对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明该方法检测时间仅需5 h，节省了大量的时间，且与传统平板计数法相比相关性大于0.998，对金黄色葡萄球菌的检测范围为10～107CFU/mL。王慧莹[36]基于计算机视觉技术对食品中的蜡样芽胞杆菌进行快速检测，并基于BP神经网络构建了识别模型，能够很好的识别目标图像区域再进行计数，识别正确率能达到95%，与传统检测方法相比更加准确快速、特异性高，检出限为50 CFU/g。王勇[37]对食品中的金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、沙门氏菌这3种致病菌经过染色处理后，结合计算机视觉技术设计了3种快速检测方法，结果表明计算机视觉技术可高效的对这3种致病菌进行检测，检测时间都在5 h之内，金黄色葡萄球菌的检测限为10～1×107CFU/mL，蜡样芽胞杆菌的检测限为50～1×106CFU/mL，对沙门氏菌的检测时间最短(2 h)，检测限为10～1×107CFU/mL。以上研究表明计算机视觉技术用于食品中致病菌的快速检测是可行的，但目前应用的致病菌种类较少，因此需要探究对更多致病菌种类的应用以及在更复杂的食品介质中进一步研究。

3.3 食品中霉菌及其毒素的检测

王振杰[30]为探究贮藏过程中稻谷的霉变情况，采用计算机视觉技术对感染5种常见霉菌的稻谷样品进行图像采集与处理，建立支持向量机模型对正常稻谷和霉变稻谷进行区分，结果可很好的识别出早期霉变稻谷和晚期霉变稻谷，但对于霉变晚期的识别模型正确率高于霉变早期。同时对这5种霉菌进行识别，结果基于菌落颜色、形态、纹理特征结合得到的识别效果最好。SHEN等[38]基于计算机视觉和可见近红外光谱对玉米中的真菌感染进行检测分析，结果表明由于不同菌株之间的颜色变化，计算机视觉技术对于真菌种类鉴定更为有效。并且采用竞争性自适应重加权算法选择特征波长的方法使预测模型准确率由77.8%提高到了94.4%。张楠楠等[39]为检测玉米中的霉菌毒素污染情况，采用不同光源照射感染黄曲霉毒素的玉米颗粒，分析其图像特征，结果成功的对感染黄曲霉毒素玉米颗粒进行了快速检测，正确检出率均为87.5% 以上。计算机视觉技术可根据霉菌及其毒素污染所造成的食品表面颜色变化，对食品中的霉菌污染进行检测以及对引起霉变的不同霉菌进行分析鉴别。但对于低水平霉菌感染的识别方面仍有些不足，还需进一步探究不同种类霉菌污染和多种霉菌污染时与食品霉变状态的关系。且计算机视觉技术用于食品中霉菌的检测多为识别分析，对于霉菌及霉菌毒素定量检测方面应用较少，检出限较高，仍不能满足国家安全标准。

计算机视觉技术可对食品中的微生物进行快速检测，相对传统检测方法更快速、高效、灵敏度高、所需成本低。计算机视觉技术依赖于图像处理和分析，因此需要更高效的图像处理方法和高分辨率的摄像机提高检测的精度和准确度。检测时容易受到环境因素的限制，空气中的粉尘、太阳光照等都可能对结果造成影响。目前研究用的计算机视觉仪器更多的是实验室自制仪器，缺少通用的、商品化的仪器检测食品微生物。

4 电子鼻技术和电子舌技术在食品微生物检 测中的应用

电子鼻技术的基本原理是模拟动物的嗅觉，通过气体传感器阵列来检测和识别复杂的挥发性气体，再通过信号转化器传输给计算机进行数据处理分析，传感器对样品中的不同气体成分会产生不同的响应信号，以此来实现对样品的检测。食品中的微生物在生长过程中会产生一些挥发性的有机化合物，电子鼻技术可以通过对这类物质的分析来达到检测食品中微生物的目的[40]。电子舌技术是一种模拟人味觉感知系统的传感器技术，能够对待测样品中的各种滋味物质产生信号，从而检测分析样品品质。电子舌技术检测食品中的微生物主要是通过测定微生物所引起的滋味物质的变化，与微生物污染状况建立相关性，从而对微生物的种类和污染程度进行鉴别区分[41]。

4.1 食品中菌落总数的检测

WANG等[42]使用电子鼻技术检测4 ℃贮藏条件下猪肉中的挥发性化合物，并同时采用平板计数法检测猪肉的活菌总数，采用支持向量机法结合偏最小二乘法建立预测模型，模型训练集和验证集相关系数分别为0.94和0.88。结果表明电子鼻响应信号和猪肉中的活菌总数有很好的相关性，电子鼻技术可用于预测猪肉中的活菌总数。CHEN等[43]为减少湿度对电导类传感器的影响，设计了一种基于比色传感器阵列的电子鼻系统对鸡肉中的总活菌数进行定量检测。并构建了BP-AdaBoost模型成功预测了鸡肉中的活菌总数，该预测集决定系数为0.811 9，均方根误差为0.543 0 lgCFU/g。韩方凯[41]通过电子舌检测鱼肉营养物质分解产物的信息来预测微生物数量，结果支持向量机模型和BP人工神经网络模型的预测集相关系数分别为0.968和0.993，预测均方根误差分别为0.516 lnCFU/g和0.217 lnCFU/g。同时用距离判别模型构建的微生物污染程度的定性模型训练集和测试集的识别正确率均为100%。表明电子舌技术可很好的检测鱼类中的菌落总数与微生物污染情况。贾哲等[44]采用TS-5000Z型电子舌测定不同时期冷藏双斑东方鲀的滋味物质，结合偏最小二乘法和多元线性回归法建立了菌落总数的预测模型，其中多元线性回归模型的性能较高，0、4 ℃组的预测集决定系数为0.97和0.99，RMSEP为0.44和0.08。结果表明该方法能较好的预测双斑东方鲀的菌落总数，并区分不同冷藏时期样品的新鲜度。在对食品中菌落总数检测方面，电子鼻技术和电子舌技术均表现出了响应信号与微生物污染水平之间良好的相关性。

4.2 食品中大肠杆菌等致病菌的检测

陈丽萍等[45]采用PEN3型电子鼻对多种食源性致病菌进行快速检测，结合主成分分析和线性判别式分析方法能将不同培养时间的细菌区分开，并且在低浓度(10 CFU/mL)情况下也可有效区分。表明电子鼻技术用于致病菌的检测是可行的。GOBBI等[46]采用基于金属氧化物传感器阵列的电子鼻测定了蔬菜汤中的大肠杆菌，对大肠杆菌的检出限为3 cells/100mL，结果准确度高且重现性好，可以很好的区分不同污染程度的蔬菜汤。ABDALLAH等[47]采用Cyranose 320型电子鼻对感染大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的牛肉和香肠进行检测，结果电子鼻技术可检测出感染不同致病菌时样品中的菌落总数，并可区分出未污染样品和已污染样品。顾欣哲[40]采用电子鼻技术检测不同温度下接种铜绿假单胞菌的猪肉，构建了猪肉中假单胞菌的生长预测模型，且与实际菌落数建立的模型相关度均高于0.8，表明电子鼻响应信号可用于监测猪肉中假单胞菌的生长动态。

4.3 食品中霉菌及其毒素的检测

黄曲霉毒素是稻谷中最常见的霉菌毒素，吴启芳[48]基于电子鼻信号对感染不同浓度黄曲霉毒素的糙米样品进行判别，偏最小二乘判别分析模型的整体判别正确率均大于85.0%，且对于小于5 μg/kg(国家标准中黄曲霉毒素的限量)水平黄曲霉毒素的分离更为清晰。沈飞等[49]采用Fox 3000型电子鼻对接种不同霉菌的花生籽粒进行检测，结合主成分分析法成功区分了被不同霉菌感染的花生样品，偏最小二乘回归分析模型对感染多种霉菌花生样品的菌落总数预测决定系数为0.814 5，预测均方根误差为0.244 0 lgCFU/g。郑飞翔等[50]采用自制的电子鼻系统对不同霉变时间的黄豆和白芸豆进行检测，采用随机共振方法提取特征值构建预测模型，黄豆霉变预测模型的R2为0.990 88，白芸豆霉变预测模型R2为0.948 77。结果得到的霉变预测模型与样品的变化状态相符合，可很好的区分不同贮藏时间的豆类样品。朱娜等[51]采用电子鼻对感染灰霉、扩展青霉和根霉的草莓进行检测，根据不同霉菌感染草莓后产生的挥发性化合物组分不同构建了判别模型，对灰霉、扩展青霉和根霉3种霉菌的判别正确率分别为100%、93.3%和86.7%。表明电子鼻技术用于草莓霉变的监测是可行的。电子鼻技术已经应用于稻谷、花生、玉米、豆类以及草莓等食品中霉菌的检测，且具有较高的灵敏度。

基于电子鼻和电子舌的响应信号能够很好的用于测定食品中的微生物以及食品霉变的区分。电子舌测定食品中微生物多用于鱼类新鲜度的测定、饮料中腐败微生物的检测。由于实际生产中食品同时受到多种细菌的污染以及污染后期食品本身所产生的挥发性物质，会导致电子鼻对于微生物种类的区分有很大的困难，因此需要探究更多种类微生物同时污染时的检测以及考虑选择性的采用合适的传感器阵列。目前所使用的电子鼻仪器主要是国外商用电子鼻或实验室自主研发仪器，自主研发仪器相对于商用仪器灵敏度更高、准确度也更好，但稳定性较差且只适用于单一食品样品的检测。未来电子鼻仪器还需要更加灵敏便捷、适用性高。

5 结论与展望

无损检测技术具有的快速无损、可在线检测等优点，使其在食品微生物检测中的应用展现了巨大的潜力，如食品中的微生物定量检测、定性鉴别；生产加工中食品微生物生长变化的在线检测；以及早期微生物感染食品的预防监控等。上述5种无损检测技术在食品微生物检测方面各有优缺点。对于未来的发展，近红外光谱技术应进一步探究多种微生物指标同时检测时的应用以及采用更高效的光谱预处理方法提高模型精确度；高光谱成像技术应更多的利用光谱信息和空间信息的融合，探究合适的特征提取方法和数据处理方法提高检测速度；对于计算机视觉技术，研究简便高效的图像处理技术和高性能的摄像机能够提高检测结果的准确度和灵敏度；而对于电子鼻和电子舌技术来说，更加灵敏的传感器阵列和合适采样方式会对这两种技术的应用有所帮助。每种技术都有其合适的适用范围，在实际生产实践时，可采用多技术融合的方法，两种或多种无损检测技术融合用于食品中微生物的检测，可更全面的检测食品中微生物的信息。无损检测技术的分析模型虽有很好的预测效果，但建立模型需要大量准确的样品数据以及投入一定的时间精力，且模型通用性不强，还需选择更多具有代表性的样本数据以及研究更高效成熟的数据分析方法用于提高模型精确度。无损检测技术仪器目前有些仍比较大型，可继续探究更加小型化、简洁化和智能化的系统装置来提高仪器的便捷性，使其能更高效的应用于实际的生产检测中。随着智能化的不断发展，未来可将无损检测技术与现代智能设备结合起来，更好地用于市场或者居民日常的食品微生物测定。