不同处理对连作障碍土壤真菌群落结构的影响

骆玉琴， 许佳彬， 李艳杰， 徐明飞， 徐玲英， 于国光， 李辉， 李慧杰， 张志恒

(浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021)

近年来，随着经济日新月异的发展及人民生活水平的逐步提升，人们对果蔬类绿色健康食品的需求日渐增大，这促使了果蔬类产业的集约化发展[1]。农产品的规模化生产种植也造成一系列弊端问题，如土壤环境微生态失衡[2]、农药使用所导致的环境污染及入口食品安全问题[3-6]、连作障碍现象加剧[7]等，其中连作障碍因其普遍性及持久性等特点极大地影响了农产品的产量及品质[8-10]，同时也是农业可持续发展亟需解决的关键问题之一。

连作障碍是指由同种或近缘作物连作造成的土壤理化性质恶化、作物病虫草害加剧、发育异常、生长态势变弱、产量降低和产品品质变劣等现象[11]。研究表明，发生连作障碍的原因众多，大概可分为非生物因素和生物因素两种。非生物因素主要指土壤自身理化性质，包括土壤中营养元素、微量元素等的缺乏会导致种植作物的连作障碍。滕凯等[12]发现，有连作障碍特点的烟草种植区，土壤理化性质存在明显差异，推测土壤理化性质的差异是导致连作障碍存在差异的主要因素之一。生物因素主要指土壤中的微生物和植物化感物质。一方面，土壤中的微生物具有促进有机物质分解与能量转化和利用等作用[13]，为农作物的生长及发育提供营养物质；另一方面，有毒的真菌菌落也可通过土壤进入作物体内从而影响农作物正常的生长，甚至导致农作物的感染死亡[14-15]。

王芳等[16]通过试验探究连作土壤种植对茄子生长的影响，结果表明，茄子自身的化感物质及病虫害是导致茄子最终发生连作障碍的重要因素。Liu等[17]研究证实了大豆连作导致种植土壤退化以及大豆产量骤降，同时也发现土壤中pH和碳氮比是导致群落结构转变的主要因素，这说明了种植作物通过改变种植土壤的理化性质间接改变土壤微生物的结构。科研人员对连续种植苦参的土壤样本进行冗余分析，结果表明，有机质、速效磷及全氮等对土壤根系微生物的影响较大，这同样也证实了种植作物生长与土壤理化指标有密切关联[18]。Li等[19]通过高通量测序手段发现在仅有花生栽培的体系中青霉菌与镰刀菌具有显著的抑制作用，这说明潜在非植物致病菌与植物致病菌之间有一定的作用关系。Wang等[20]结合高通量测序与定量PCR两种手段对烤烟连作种植后土壤中真菌群落进行探究，发现烤烟连作后明显改变了土壤中真菌的丰度及多样性，同时也增加了再次种植作物感染病原菌的几率。最新研究成果表明，相对于细菌群落，病原菌Fusariumoxysporumf. sp. capsici对真菌群落的影响更为突出[21]。

绍兴市是浙江省东北部地区茄果类蔬菜种植产量大市之一，绍兴地区农产品种植多采用大棚种植方式[22]。近年来，由于种植模式及种植作物单一化，土地种植作物连作障碍现象频发，给种植户带来了严重的经济损失[23]。但就目前来说，对该地区连作土壤的研究及治理罕见报道。本文采用4种不同方式处理该地区连作土壤，采用ITS测序手段探究不同处理后土壤中真菌群落结构的多样性和特征变化，尤其是有害病原菌的数量及种类，为进一步防御茄果类蔬菜连作障碍提供重要理论指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试土壤采集于浙江省绍兴市上虞区茄果类蔬菜多年种植地块，该地块青枯病、黄萎病等病害高发。在种植区随机选取10个点采集土壤，采样深度为0～20 cm，剔除石块和植物根系后，过2 mm筛后混匀备用。

供试有机物料为大豆秸秆，风干后粉碎，碳氮比(C/N)为20.4。供试杀菌剂为氰氨化钙、棉隆、二氧化氯。

1.2 处理设计

试验共设计厌氧还原法、覆膜增温法、熏蒸剂处理法和消毒剂处理法4种处理方式，10个处理组，每个处理组均进行3次重复，试验开始前，测定供试土壤的持水量(表1)。

表1 试验处理的设计

1.3 测定项目

土壤中真菌的测定中，为最大程度地减少实验方法所带来的实验结果误差，所有待测样品的预处理方式、样品的基因组DNA提取及ITS扩增子测序皆采用统一的实验方法。经预处理过的样品送至浙江天科高新技术发展有限公司，采用PowerSoil®DNA Isolation Kit(MO BIO，Cat.No.12888)方法对样本的基因组DNA进行提取，DNA提取后利用琼脂糖凝胶电泳检测产物的纯度和浓度。取适量的所得产物DNA为模板，基于测序区域的选择，PCR反应体系中主要包括特异引物(带Barcode)、高效高保真酶以及High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(Phusion®，New England Biolabs)等以保证扩增效率以及后续准确提取DNA、PCR、产物纯化、建库以及使用Illumina测序仪完成土壤样品的测序试验工作。真菌ITS扩增引物为：ITS1-5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′；ITS2-5′GCT GCGTTCTTCATCGATGC3′。所有PCR反应均采用Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)进行，将同样体积的1×负载缓冲液(含SYBR染料)与PCR产物混合，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。选择400～450 bp明亮条带的样品进行后续实验。PCR产物按等比混合后，用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen，Germany)纯化混合PCR产物。根据制造商的说明书，使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina，USA)生成测序文库，并添加索引代码。文库质量在Qubit@2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)and Agilent Bioanalyzer 2100 系统上进行评估。最后，在IlluminaMiSeq平台上对文库进行测序，生成300 bp的对端reads。试验的所有样本均在同一Illumina MiSeq测序仪完成测序工作。

1.4 数据处理

为了方便探究而设定的分类操作单元OTU是使用软件uparse对所有土壤样本中真菌的有效tags进行聚类讨论，对OTU进行分类学注释使用的数据库为Unite数据库，通过物种注释即可了解不同水平上(界、门、纲、目、科、属等)的序列数目。通过软件Qiime进行物种多样性指数及丰富度指数的计算，统计分析采用Microsoft Excel 2010进行相关数据的处理，利用Origin 2016完成对病原菌的组成分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对土壤真菌群落多样性的影响

测序完成后所得到的原始读数经过拼接、修剪、过滤等优化手段处理后共得到498 510条高质量序列。为研究土壤样本中的物种组成多样性，使用uparse软件对所有土壤样本进行聚类讨论，以97%一致性水平的基础将序列聚类成为OTUs，共检测出3 257个OTUs，所有处理样本中T5和T8中OTU数量分别为最高和最低，分别为365和152个(表2)。各处理样本中真菌的测序深度指数0.997 7～0.999 9，说明了测序数据较高程度地覆盖了样本中所有的真菌类群，能够真实代表样本中的真菌特征。样本T8中的测序深度指数最高(0.999 9)，高于样本T6。Shannon指数2.76～5.06，Simpson指数0.615～0.932，Ace指数154～413，Chao1指数154～419，多样性指数所得结果表明在4个处理组中覆膜增温处理后对土壤样本中真菌的群落多样性影响最为显著，说明了覆膜增温至60 ℃(比较35 ℃)会显著增加土壤中真菌群落结构的多样性，这可能与温度影响相关酶活性有关[24]，厌氧还原处理组中T1降低真菌的多样性指数，T2和T3增加了真菌的多样性指数，其中T3中多样性指数增加幅度较小。分析熏蒸剂处理组中多样性指数数据发现，T7和T8处理组多样性指数均高于T6对照组，这间接说明了氰氨化钙和棉隆这两种熏蒸剂在10 d的作用时间内反而增加了土壤中真菌的多样性指数，这与预期结果不符，可能是作用时间和剂量的问题[25]。采用消毒剂处理后发现二氧化氯会降低真菌群落的多样性。同时也表明Shannon和Simpson指数的指向性一致。而丰富度指数表明4个处理组中熏蒸剂处理后对土壤中真菌的丰富度均降低，相对于氰氨化钙比较而言，棉隆熏蒸后显著降低真菌的丰富度。与对照组比较，厌氧还原处理组中均降低了土壤中真菌的丰富度指数，但并不显著。而二氧化氯消毒剂处理后会增加土壤中真菌的丰富度指数。

表2 不同处理方式的土壤真菌群落多样性指数

2.2 不同处理对土壤真菌群落结构的影响

土壤样本中共检测到真菌界15个门40个纲85个目197个科378个属580个种的微生物。从门水平上分析，各不同处理后的土壤样本Top 10相对丰度所占比例为94.66%～99.72%，能够较为详尽地涵盖整个真菌群落门水平上的信息，其他种类的门相对丰度数据合并成others，占比为0.28%～5.34%。Top 10分别为子囊菌门(Ascomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、捕虫霉门(Zoopagomycota)、毛霉门(Mucoromycota)、虫霉门(Entomophthoromycota)、油壶菌门(Olpidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和芽枝霉门(Blastocladiomycota)。

由图1可以看出，Ascomycota是所有样本中相对丰度最高的菌门，所占比例为40.28%～95.04%，其中在T4(对照)组中Ascomycota的相对丰度最高为95.04%，T8组中Ascomycota的相对丰度最低为40.28%。分析不同处理后对菌门Ascomycota相对丰度的影响发现，厌氧还原处理组中随着厌氧程度加深，Ascomycota的相对丰度显著下降。覆膜处理组中在60 ℃培养条件下连续作用10 d后发现Ascomycota的相对丰度显著下降。熏蒸剂处理组中，氰氨化钙和棉隆对Ascomycota的生长均有一定的抑制作用，其中棉隆显著抑制其生长。消毒剂处理组中二氧化氯连续作用24 h使得Ascomycota的相对丰度显著升高。对比覆膜处理组和熏蒸剂处理组数据发现(两组的作用时间相同，均为240 h)，相对于温度(60 ℃)而言，菌门Ascomycota对熏蒸剂棉隆表现更为敏感。综合4组数据分析发现，棉隆处理组对Ascomycota的抑制性作用最为显著。对于菌门Chytridiomycota，厌氧还原组和熏蒸剂处理后其相对丰度显著增加，覆膜法和消毒剂处理中Chytridiomycota的相对丰度显著降低，其中消毒剂组抑制作用更为显著。对于菌门Mortierellomycota，厌氧还原组及氰氨化钙处理后其相对丰度均有所降低，覆膜法、棉隆及消毒剂处理均显著增加Mortierellomycota的相对丰度，其中覆膜法影响最为显著。对比数据发现，只有在T4样本中没有检测到Entomophthoromycota，而覆膜增温处理后其相对丰度却显著增加。在样本T1、T4和T8均没有检测到菌门Blastocladiomycota，对于T8而言，氰氨化钙和棉隆作用后分别增加和降低了菌门Blastocladiomycota的相对丰度，其中棉隆熏蒸导致Blastocladiomycota难以生存。

图1 门水平上不同处理后土壤中真菌的组成

进一步从属水平上分析不同处理对土壤真菌群落的影响(图2)，除了未定义的菌属之外(Others)，共检测到378个真菌属。各不同处理后的土壤样本Top 10的相对丰度所占比例为46.25%～86.91%，基本能够涵盖整个真菌群落属水平上的概况，其他种类属的相对丰度数据合并成others，占比为13.09%～53.75%，Top 10菌属分别为毛壳菌属(Chaetomium)、瓶毛壳属(Lophotrichus)、被孢霉属(Mortierella)、Gymnostellatospora、毛壳属(Chaetomidium)、根生壶菌属(Rhizophydium)、缘刺盘菌(Cheilymenia)、瑞恩氏酵母属(Ruinenia)、Retroconis和Gorgonomyces。

图2 属水平上不同处理后土壤中真菌的组成

由图2可以看出，样本T4中Chaetomium属的相对丰度最高，而覆膜处理后发现显著降低了Chaetomium属在样本中的相对丰度，这侧面说明了Chaetomium属对温度具有较高的敏感度，同时发现厌氧还原和熏蒸剂处理后均对Chaetomium属的生长有一定的抑制作用，但抑制程度远远小于覆膜处理组。对于Lophotrichus属，在厌氧还原处理后发现，样本T1中其相对丰度显著降低，而在T2和T3中Lophotrichus属的相对丰度略有上升。覆膜处理后Lophotrichus属的相对丰度显著性下降，氰氨化钙和棉隆两种熏蒸剂处理后发现作用结果不相同，氰氨化钙和棉隆分别升高和降低了Lophotrichu属的相对丰度。对于Mortierella属，厌氧还原作用后显著降低了Mortierella属的相对丰度，覆膜处理后Mortierella属的相对丰度显著升高，而不同熏蒸剂处理后对Mortierella属的影响不尽相同，氰氨化钙和棉隆分别降低和升高了Mortierella属的相对丰度，这与Lophotrichus属对两种熏蒸剂出现的结果正好相反。对于Gymnostellatospora属，厌氧还原作用和熏蒸剂处理后对其影响并不明显，而覆膜后显著降低了Gymnostellatospora属的相对丰度。厌氧还原处理后Chaetomidium属仍具有良好的适应性，并且Chaetomidium属的相对丰度显著性增加，其中T1样本中增幅最高，而覆膜后显著降低了Chaetomidium属的相对丰度，Chaetomidium属遇到氰氨化钙和棉隆熏蒸后的结果与Lophotrichus属表现一致。而在二氧化氯作用后Chaetomium属、Lophotrichus属、Mortierella属、Gymnostellatospora属和Chaetomidium属的相对丰度有不同程度的增加，其中Chaetomium属和Mortierella属的相对丰度显著增加。在样本CK、T6和T8中均未曾检测到Rhizophydium属。

2.3 不同处理方式对致病菌的影响

根据测序数据可知，在土壤样本中检测出的378个真菌属中，镰刀菌属(Fusarium)、交链孢属(Alternaria)、轮枝孢属(Verticillium)和葡萄孢菌属(Botrytis)是主要的植物致病菌。

不同处理对上述4个植物病原菌属组成的影响如图3所示，4种病原菌属相对丰度占总菌属比例的0.41%～3.54%，其中Fusarium为Top 1病原菌，镰刀菌属相对丰度占总菌属比例为0.41%～3.50%，而CK和T1为厌氧还原处理中的一组，这直接说明了厌氧还原处理后对Fusarium的显著抑制效果，对比数据发现，T2和T3的抑制效果依次递减，T1、T2和T3对Fusarium的抑制率分别为88.47%、70.88%和42.8%。同样对Fusarium具有抑制效果的处理有T8，抑制率为67.92%。覆膜增温后发现Fusarium的相对丰度增加至对照组的4倍多，而氰氨化钙和二氧化氯处理后，T7和T10组中镰刀菌属的相对丰度略有增加。综合数据可知，T1处理对镰刀菌属的抑制作用最为显著。对Alternaria属具有抑制作用的分别为T1和T3，抑制率分别为86.36%和81.82%，其余处理组表现为促进Alternaria属对环境的适应性，其中T10的促进效果最高。对于Verticillium属，除了二氧化氯增加了该菌属的环境适应能力，其余处理组均对Verticillium属具有明显的抑制结果，尤其值得注意的是T2、T3和T8对其抑制率达到了100%。同样，厌氧还原处理对病原菌属Botrytis的作用为抑制，且抑制效果同样达到了100%，在对照组T4、T6和T9中均未检测出Botrytis属，而T5和T8处理后该菌属的相对丰度分别为0.027%和0.013%，T7和T10处理后Botrytis属的相对丰度无改变。

图3 不同处理后4种病原菌属的组成变化

3 讨论

真菌是农作物土壤介质中不可或缺的成员之一，对其多样性及群落组成的研究具有积极的应用需求。本文以浙江北部茄果类连作障碍土壤为研究对象，探究厌氧还原、覆膜增温、熏蒸剂和消毒剂等不同的处理方式对连作土壤中真菌的多样性及群落结构的影响。对比其他处理结果，覆膜增温处理显著增加了真菌群落的多样性，而连续作用相同时间后棉隆熏蒸处理显著降低了真菌群落的丰富度指数。在门水平上，Ascomycota、Chytridiomycota、Mortierellomycota、Basidiomycota和Zoopagomycota为土壤样本中的优势菌门，相对丰度合计占93.17%～99.55%。对比数据发现，温度由35 ℃增加至60 ℃，Ascomycota门的环境适应能力大大降低，而经二氧化氯处理后Ascomycota门的相对丰度显著增加。从属水平分析，共检测出378个属，覆膜增温处理后，Ascomycota门中Chaetomium属的相对丰度显著降低，这进一步说明了Ascomycota门相对丰度的下降主要是其中Chaetomium属的下降。对Fusarium、Alternaria、Verticillium和Botrytis等连作障碍主要致病菌属分析表明，其中Fusarium为Top 1病原菌，而厌氧还原组对Fusarium具有最强的抑制效果，抑制率为88.47%。不同类型的土壤连作障碍及其相关处理技术与土壤真菌群落的定量关系有待后续进一步研究。